晾曬煙調制過程中酶促棕色化反應及調控方法

李秀妮 ，喬保民 ，吳 創(chuàng) ，田煜利 ，萬德建 ，時向東

（1.河南農業(yè)大學，河南鄭州450002；2.湖北省煙草公司恩施州公司，湖北恩施445000）

酶促棕色化反應是一系列復雜的生物化學反應，在晾曬煙的調制過程中，煙葉因饑餓代謝而消耗大量的內含物質，因此，外觀顏色會隨調制的進行不斷發(fā)生改變，其顏色的變化為“淡綠—黃綠—淡黃—正黃—深黃—棕色—褐色”[1]。Akaike等[2]對日本煙草var.Shirodaruma在晾制過程中色素的變化進行了研究，在由綠變黃階段，顏色發(fā)生變化的實質原因是在葉綠素的降解作用下發(fā)生酶促棕色化反應所致。適當促進酶促棕色化反應的進行，將有利于晾曬煙品質的提升，但若環(huán)境溫濕度條件或煙葉失水速率控制不當，就極易使酶促棕色化反應發(fā)生過度，導致晾曬煙發(fā)黑、霉變、甚至腐爛，嚴重影響煙葉的外觀質量和抽吸品質[3]。因此，如何調控酶促棕色化反應的進行對晾曬煙調制具有重要意義。

1 酶促棕色化反應的過程與本質

1.1 酶促棕色化反應過程

國外對酶促棕色化反應的研究始于20世紀70年代，國內開始于20世紀80年代，目前已經取得了很大的進展[4]。酶促棕色化反應主要發(fā)生在煙葉變黃末期至調制結束這一過程中。當調制進行至變黃末期，原本束縛于細胞內的氧化酶類隨著葉肉組織逐漸死亡，細胞膜系統(tǒng)透性逐漸增大而滲入細胞間隙中，從而與細胞間隙內的多酚類物質發(fā)生直接接觸，生成大量醌類物質。同時，細胞膜系統(tǒng)透性的增大使活性氧能自由進出煙葉組織，促使葉片內氧化酶（特別是多酚氧化酶PPO）的活性增強，從而促進細胞內多酚類物質的氧化[5－6]，葉片內最終物質的氧化還原平衡被破壞，醌類物質大量生成和聚合使煙葉顏色加深[7]。

1.2 酶促棕色化反應本質

Matheis等[8]研究表明，植物組織中的酚、酶一經接觸，將會發(fā)生一系列反應。首先一元酚經甲酚酶催化生成鄰－二羥基化合物，然后在多酚氧化酶的催化作用下，鄰－二酚被氧化成鄰－本醌，最后鄰－本醌繼續(xù)變化，生成高分子聚合物。此外，氨基酸或蛋白質與鄰－苯酚作用生成高分子的絡合物，這些物質會導致褐色素的生成。例如，在晾曬煙調制和發(fā)酵過程中兒茶酚棕色化反應就是煙葉變褐的重要過程[9]。在這個過程中，首先兒茶酚在多酚氧化酶作用下氧化成鄰醌，隨后鄰醌或沒有氧化的兒茶酚在酚羥化酶催化下進行第二次羥基化作用，生成三羥基化合物；鄰醌具有強氧化能力，能將三羥基化合物氧化成羥基對醌或羥基鄰醌，此反應無需酶參加；羥基醌容易聚合，這是主要的褐變反應，且隨著聚合度的加大，顏色由紅變褐，最終產生褐色的黑色素。所以，酶促棕色化反應的實質在于煙葉中的酚類物質（如綠原酸、咖啡酸、蕓香苷等）和自身為黃色的黃酮類物質在煙葉變黃過程中轉化為多酚類物質，它們經過氧化產生淡紅色乃至黑褐色的醌類物質，最終使煙葉顏色加深[10]。因此，煙葉的酶促褐變本質上是多酚氧化酶間接作用的結果[11]。

2 煙葉調制階段酶促棕色化反應發(fā)生的條件及影響因素

2.1 外在因素

煙葉調制時誘導酶促棕色化反應發(fā)生的外部環(huán)境因素主要有兩個，一是調制溫度，二是環(huán)境相對濕度，兩者共同影響煙葉內的水分含量和煙葉內酶的活性，進而影響棕色化反應的發(fā)生[12]。一般來說，當調制環(huán)境的相對濕度高于60%，溫度在45～46℃且煙葉失水量少于50%時，將導致酶促棕色化反應的發(fā)生。但是，即使水分含量較高的新鮮煙葉，在此溫度范圍內，只要環(huán)境相對濕度控制在60%以下，煙葉在變黃末期的失水量大于50%，則棕色化反應就不易發(fā)生[11]。

2.2 內在因素

2.2.1 變黃后期煙葉組織含水量 煙葉的生命活動狀態(tài)是保證酶促棕色化反應進行的必要條件[13]，而煙葉生命活動的強弱是由葉片水分狀況決定的[14]。因此，當葉片處于變黃末期時，煙葉中的含水量直接決定了能否發(fā)生酶促棕色化反應[15]。若變黃階段失水量過少，則煙葉黃而僵硬，在后期調制階段隨著溫度的上升，極易發(fā)生酶促棕色化反應。若失水量適當，則酶活性得到抑制，酶促棕色化反應即可得到有效控制[16]。

2.2.2 煙葉組織細胞結構的完整性 隨著調制過程的不斷進行，組織細胞結構被破壞[17]。細胞內的各種物質與酶類混合在一起相互作用，促使酶促棕色化反應發(fā)生。細胞結構被破壞使氧分子能自由進出細胞，氧化酶類活性增強，酶促棕色化反應速度加快[18]。所以，細胞結構破壞的速度和程度直接影響了酶促棕色化反應進行的速度和進程。

2.2.3 煙葉組織細胞多酚氧化酶（PPO） 活性多酚氧化酶（PPO）作為酶促棕色化反應的介導物，其活性的大小直接影響該反應的速度[11]。酶活性大小與細胞內能自由進出氧分子量的多少成正相關，也與溫度有直接關系。一般溫度低時，多酚氧化酶（PPO）活性較低，但隨著溫度升高，活性有上升趨勢。若在溫度升高的同時，配合相對濕度的降低，則多酚氧化酶活性會隨著調制時間的延長而逐漸降低[19]。

3 晾曬煙葉調制過程中酶促棕色化反應的調控

3.1 多酚氧化酶（PPO）活性的調控

3.1.1 溫度與相對濕度 一般來說，溫度對多酚氧化酶（PPO）的活性影響主要在以下兩個方面：一方面當溫度在45～50℃、相對濕度60%以上時隨著溫度的升高，酶活性降低；另一方面在溫度55℃、相對濕度60%以下時隨著溫度的升高，活性酶的比例下降[20]。因此，多酚氧化酶（PPO）最終的活性大小是由這兩方面綜合作用決定的。除溫度外，煙葉內水分含量對多酚氧化酶（PPO）活性大小也是至關重要的。在變褐期調制房內溫度為16～32℃，濕度控制為65%～75%條件下進行調制可獲得較理想的效果[21]。雷東鋒等[22]通過對煙葉水分含量與多酚氧化酶（PPO）活性關系的分析發(fā)現(xiàn)，煙葉水勢條件為－872.78 kPa時，多酚氧化酶（PPO）活性最高。因此，要想進行適宜的酶促棕色化反應就應該在煙葉調制過程中對其環(huán)境溫度和相對濕度進行相應的技術調控。

3.1.2 環(huán)境pH值 酸堿度是酶賴以生存的環(huán)境條件，每種酶只有在其適宜的pH值范圍內才表現(xiàn)出應有的活性。戴亞等[23]研究指出，引起酶促褐變的適宜pH值范圍在4～7之間，降低或提高介質中的pH值，可以控制多酚氧化酶（PPO）活性。韓富根等[24]研究表明，在18～20℃條件下，煙葉中多酚氧化酶（PPO）在pH值為6.0時活性較強，在偏堿條件下，酶活性下降較快。在煙葉晾制過程中，若在調制房內放置具有一定酸堿度的Ca、K、Mg鹽溶液即可調節(jié)pH值。

3.1.3 激活劑和抑制劑 CuCl2對多酚氧化酶（PPO）具有激活作用。銅離子有增強酶活性的功能，是煙草多酚氧化酶的良好激活劑。雷東鋒等[22]研究表明，當銅離子濃度在 0.1～1.0 mmol·L－1濃度范圍內，多酚氧化酶（PPO）活性凈增長百分率隨Cu2+濃度增加而增加，但增長幅度逐漸趨于平緩。李榮林等[25]對該酶性質進行了系統(tǒng)研究時發(fā)現(xiàn)，將該酶的最適溫度上升至40℃，最適pH值上移至7.0，酶對金屬離子的適應性增強，對抑制劑敏感性下降。多個試驗表明，在相同濃度下CuSO4對多酚氧化酶抑制作用最強，其次是EDTA、對苯二酚、巰基乙醇和硫脲[26－28]。

3.2 環(huán)境氧氣濃度的調控

煙葉酶促棕色化反應發(fā)生的一個重要條件是氧氣的參與[29]，通過對調制房氧氣濃度的控制可有效調控該反應進行的速度。有研究指出，在煙葉調制過程中，當環(huán)境氧氣體積分數（濃度）高于5 000×106時，隨著氧氣濃度的增加煙葉褐變程度逐漸加重[30]。但當環(huán)境氧氣體積分數（濃度）在100×106時，酶促褐變基本上不會發(fā)生。因此，降低調制環(huán)境中氧氣的濃度可有效減少棕色化反應的發(fā)生。另有研究發(fā)現(xiàn)，如果人為改變調制環(huán)境中氣相成分的組成比例（比如人工填充氮氣和二氧化碳），降低煙葉周圍氧氣濃度，則能抑制多酚氧化酶（PPO）的活性[31]。范堅強等[32]通過對密封煙垛進行降氧處理，在一定程度上抑制了酶促棕色化反應的發(fā)生。

4 展 望

目前，酶促棕色化反應對煙葉感官質量和外觀質量的意義已被廣泛認可[11]，而非酶促棕色化反應理論則常應用于白肋煙的高溫處理和煙絲加香加料中以改善煙葉品質[33]。因此，如何合理地進行調控是煙草科技工作者不懈努力和關注的問題。現(xiàn)階段，調制過程中的調控方法一般都從控制氧氣濃度、調節(jié)多酚氧化酶（PPO）活性兩方面來進行。雖已取得了較好的效果，但都還存在一定的局限性。僅從這兩方面入手，一方面資源投入量較大，經濟成本較高，另一方面，需要消耗大量的人力勞動。因此，如何探索出更加簡單高效且經濟的調控方法是所有煙草研究者共同努力的目標。

有研究表明，植物自身存在某些可打破多酚氧化酶（PPO）潛伏狀態(tài)的激活劑，如菠菜中的亞麻酸、蠶豆中的游離脂肪酸等[34]。同樣，多酚氧化酶（PPO）的天然抑制劑也存在，如茶葉中的白花青素、橡黃素、菠菜葉中的草酸鹽等[35]。筆者認為，煙葉自身也很有可能存在多酚氧化酶（PPO）激活劑和抑制劑，在調制過程中通過對環(huán)境的適當調控使激活劑和抑制劑適當表達，或者通過基因調控手段對多酚氧化酶（PPO）表達進行調控，將會對酶促棕色化反應起到調控作用，有利于晾曬煙品質的提升。因此，探索晾曬煙自身多酚氧化酶（PPO）表達以及采用天然激活劑和抑制劑的調控方法，是進一步調控酶促棕色化反應提高煙葉質量的方法，并且也將是今后探索的方向。

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