熒光探針法檢測(cè)廢水中劇毒硫化物的應(yīng)用探究

吳安洋

摘要：本文設(shè)計(jì)并合成了一種有機(jī)熒光功能探針分子，并用于檢測(cè)水中劇毒污染物苯硫酚的含量。分子設(shè)計(jì)基于反應(yīng)型原理，在待測(cè)水樣本中加入探針分子，探針分子與苯硫酚發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，釋放出熒光團(tuán)。在特定波長的激發(fā)下，探針分子發(fā)出熒光，從而檢測(cè)苯硫酚的存在并對(duì)其含量進(jìn)行精確測(cè)量。熒光強(qiáng)度與苯硫酚濃度相對(duì)應(yīng)，通過制成工作曲線，即可對(duì)未知樣品中苯硫酚的含量進(jìn)行測(cè)定。在本課題中，通過熒光工作曲線最終測(cè)得待測(cè)樣品的苯硫酚含量為3.28M。

關(guān)鍵詞：熒光探針；苯硫酚；實(shí)際樣品檢測(cè)；光致電子轉(zhuǎn)移

1.研究背景

1.1 苯硫酚

苯硫酚是一種化學(xué)式為C6H5SH的有機(jī)硫化合物，也可以寫成PhSH。它是一種無色液體，具有特殊的難聞氣味。由于它是一種非常重要的化學(xué)中間體，因此被廣泛用于合成農(nóng)藥，催化劑，阻聚劑，燃料等。它是一種劇毒化合物，對(duì)眼睛，粘膜，呼吸道和皮膚有很強(qiáng)的刺激性。呼吸苯硫酚可能會(huì)導(dǎo)致中毒，甚至在嚴(yán)重時(shí)死亡。[1]長期接觸苯硫酚會(huì)導(dǎo)致中樞神經(jīng)和其他神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重受損，包括呼吸短促，肌肉無力，后肢癱瘓，昏迷，甚至死亡，半數(shù)致死劑量（LC50）魚用0.01-0.4mM。[2，3]

1.2 目前用于苯硫酚檢測(cè)的方法

目前，主要有四種檢測(cè)苯硫酚的方法，即碘化，紫外吸收光譜法，電化學(xué)分析和熒光分析（本文所采用的方法）。[4，5]與目前的熒光光譜法相比，其它方法準(zhǔn)確性較低，時(shí)間消耗較大，儀器昂貴以及預(yù)處理較為繁瑣。[6]

1.3項(xiàng)目設(shè)計(jì)

在本文中，為了找到更好的方法來檢測(cè)廢水中的苯硫酚，以便消除苯硫酚污染，探索熒光分析的實(shí)用性，設(shè)計(jì)了一種熒光探針，可以特異性地檢測(cè)苯硫酚的存在并發(fā)出熒光。設(shè)計(jì)的分子主要由三部分組成：熒光報(bào)告組，檢測(cè)位點(diǎn)和PEG鏈。選擇1，8-萘二甲酰亞胺作為熒光報(bào)告組。檢測(cè)部位為2，4-二硝基苯磺酸鹽，可以淬滅報(bào)告組的熒光。PEG鏈將幫助探針溶解在水中以檢測(cè)苯硫酚。在與分析物（硫醇酚，一種劇毒的工業(yè)廢物）發(fā)生親核反應(yīng)后，從探針上切下2，4-二硝基苯磺酸猝滅劑基團(tuán)，探針再次以1，8-萘二甲酰亞胺的強(qiáng)熒光發(fā)光。因此可以檢測(cè)廢水中的有毒分析物。

2.實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑和儀器

除非另有說明，否則所有試劑均按標(biāo)準(zhǔn)說明進(jìn)行使用。所有氧氣或濕氣敏感反應(yīng)均在氬氣氛下使用標(biāo)準(zhǔn)Schlenk方法進(jìn)行。所有其他試劑均具有分析純度，無需進(jìn)一步處理即可使用。使用的溶劑是分析級(jí)的，除了重結(jié)晶和光學(xué)測(cè)試之外，在使用前蒸餾。在涂有硅膠60F254（MERCK）的鋁板上進(jìn)行薄層色譜（TLC）。使用Bruker AM-400光譜儀記錄1 H NMR光譜。DMSO-d6，CDCl3用作溶劑。分別使用Varian Cary 500和Varian Cary Eclipse記錄吸收和熒光光譜。

2.2合成與表征

合成路線如圖2-1所示。合成目標(biāo)產(chǎn)物化合物5主要有兩個(gè)步驟。

化合物3的合成

在反應(yīng)之前，首先用氬氣氛填充反應(yīng)器。使用雙瓶頸燒瓶，其中一個(gè)頸部與三通閥連接。將閥門連接到充滿氬氣的氣球上。首先用油泵抽出燒瓶中的空氣，然后打開閥門，用氬氣填充燒瓶。重復(fù)三次后，認(rèn)為燒瓶充滿氬氣氛，為下面的反應(yīng)做好準(zhǔn)備。

將0.10g化合物1（0.30mmol）和2.0mL TEA溶解在10.0mL DCM中。然后將0.13g化合物2（0.40mmol）的5.0mL DCM溶液逐滴加入溶液中，通過漏斗。將反應(yīng)保持過夜直至TLC顯示反應(yīng)完成。然后加入飽和NaCl溶液洗滌三次，分離有機(jī)層。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)有機(jī)溶劑。通過二氧化硅柱純化得到的殘余物，洗脫液為DCM：甲醇= 100：1（v / v）。得到黃色產(chǎn)物（0.17g），產(chǎn)率80%。

化合物5的合成.

將50.0mg（0.10mmol）化合物3，20.0mg（0.10mmol）PEG和9.30mg（0.025mmol）四（乙腈）銅（I）六氟磷酸溶于10mL DCM /水（4：1）的混合溶液中，v / v）雙瓶頸燒瓶。作為第一步，向燒瓶中充入氬氣。在室溫下反應(yīng)5小時(shí)后，加入水以淬滅反應(yīng)。保留有機(jī)相并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸發(fā)。柱色譜（DCM的洗脫液：甲醇= 100：1（v / v））用于純化產(chǎn)物，得到目標(biāo)產(chǎn)物化合物5（0.13g），產(chǎn)率70%。

3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 探測(cè)對(duì)苯硫酚的熒光反應(yīng)

在Varian Cary Eclipse熒光光譜儀上測(cè)量所有熒光光譜。通過將7.7mg探針溶解在10mL DMSO中來制備探針的1mM儲(chǔ)備溶液。然后將2mL PBS緩沖溶液（0.01M pH = 7.4）加入到光程為1cm的石英比色杯中。然后將10μM探針原液移至細(xì)胞中，使最終濃度為5μM。以相同方式制備濃度為2mM的苯硫酚在DMSO中的儲(chǔ)備溶液。連續(xù)添加2到10？M。將苯硫酚儲(chǔ)備溶液加入含有5μM探針的比色杯中，得到一系列含有苯硫酚的溶液，濃度為2至10μM。然后測(cè)試具有不同比例的苯硫酚的探針的熒光，激發(fā)波長為400mm，發(fā)射波長為530mm（圖3-1）。隨著苯硫酚添加量的增加，隨著噻吩酚淬滅2，4-二硝基苯磺酸鹽單元，探針的熒光顯著且迅速地增強(qiáng)。這種明顯的現(xiàn)象表明我們?cè)O(shè)計(jì)的探針對(duì)苯硫酚底物的快速響應(yīng)。

進(jìn)一步驗(yàn)證了我們的探針對(duì)其他含硫化合物的選擇性。將各種選擇的陰離子（100μM）和氨基酸（100μM）加入到探針溶液（5μM）中，溫育2分鐘，然后記錄熒光光譜。如圖3-2所示，與苯硫酚相比，沒有觀察到明顯的信號(hào)，因?yàn)槠渌x子和有機(jī)化合物被添加到探針溶液中。因此，設(shè)計(jì)的探針對(duì)其他含硫化合物的苯硫酚表現(xiàn)出良好的選擇性。

4.實(shí)驗(yàn)結(jié)論與展望

成功設(shè)計(jì)了一種對(duì)苯硫酚具有快速準(zhǔn)確檢測(cè)性能的熒光探針。該探針用于檢測(cè)真實(shí)水樣和活細(xì)胞中苯硫酚的濃度，證明了其在環(huán)境和生物分析中的廣泛應(yīng)用。與傳統(tǒng)的苯硫酚分析方法相比，新設(shè)計(jì)的熒光探針具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：i）設(shè)計(jì)的探針易于合成，并且當(dāng)呈現(xiàn)苯硫酚時(shí)證明具有快速熒光。 ii）隨著苯硫酚濃度的增加，熒光強(qiáng)度呈線性增加，檢出限降至10.8 nM。 iii）設(shè)計(jì)探針選擇性地響應(yīng)苯硫酚衍生物而不是其他含硫化合物和常見離子，使其具有高靶選擇性。 iv）探針表現(xiàn)出低細(xì)胞毒性，這是生物傳感的先決條件。因此，快速響應(yīng)，低LOD，高選擇性以及環(huán)保和低細(xì)胞毒性特征使得探針在環(huán)境和生物應(yīng)用中的實(shí)際和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)苯硫酚方面更有能力。

參考文獻(xiàn)：

[1]Zheng W， Deman H， Wenping J， Qizhong Zhou， and Weiping Deng.Reaction-Based Fluorescent Probe for Selective Discrimination ofThiophenols over Aliphaticthiols and Its Application in WaterSamples[J]. Anal. Chem.， 2012， 84： 4915？4920.

[2]Yongshun W， Yu L， Xiaofeng Y， Minjuan W. Rapid Determination of Thiophenol by UV-Vis Spectrophotometry[J]. Chemical AnalysisAnd Meterage， 2014， 23（6）： 85-87.

[3]W Zhang， F Huo， T Liu， Y Wen， C Yin. A rapid and highly sensitive fluorescent imaging materials for thiophenols [J]. Dye Pigments， 2016， 133： 248-254.

[4]W Jiang， Cao Y T， Liu Y， et al. Rational design of a highlyselective and sensitive fluorescent PET probe for discrimination ofthiophenols and aliphatic thiols[J].Chem.Commun.， 2010， 46： 1944-1946.

[5]Morina A， Yosuke H， Tsuyoshi Y， et al. Antifeedant andtermiticidal activities of 6-alkoxycoumarins and related analogsagainst coptotermesformosanusshiraki[J]. J. Chem. Ecol.，2011， 37： 598-606.

[6] Wang Z， Han D M， Jia W， et al. Reaction-based fluorescent probefor selective discrimination of thiophenols over aliphaticthiolsand its application in water samples[J]. Anal. Chem.， 2012， 84： 4915-4920.

[7] Youxin F. Application of Photochromic Fluorescence Glycoprobes in Cell Imaging and Ion Detection[D]. Shanghai： East China University of Science and Technology， 2017

[8] A. Prasanna de Silva， H. Q. NimalGunaratne， ThorfinnurGunnlaugsson， Allen J. M. Huxley， Colin P. McCoy， Jude T. Rademacher， Terence E. Rice. Signaling recognition events with fluorescent sensors and switches [J]. Chem. Rev.， 1997， 97（5）： 1515-1566.

[9] Jong Seung Kim， Duong Tuan Quang. Calixarene-derived fluorescent probes [J]. Chem. Rev.， 2007， 107（9）： 3780-3799.

[10] Jiangli Fan， Mingming Hu， Peng Zhan， XiaojunPeng. Energy transfer cassettesbased on organic fluorophores： construction and applications in ratiometric sensing [J]. Chem. Soc. Rev.， 2013， 42（1）： 29-43.

[11] Yan Feng， Jinghui Cheng， Li Zhou， Xiangge Zhou， Haifeng Xiang. Ratiometric optical oxygen sensing： a review in respect of material design [J]. Analyst， 2012， 137（21）： 4885-4901.

[12] Daniel P. Kennedy， Chad M. Kormos， Shawn C. Burdette. Ferribright： A rationally designed fluorescent probe for redox active metals [J]. J. Am. Chem. Soc.， 2009， 131（24）： 8578-8586.

[13] G L Long， J D Winefordner， Limit of detection： a closer look at the IUPAC definition [J].Anal. Chem.， 1983， 55： 712A-724A.