紫草油對(duì)肛瘺術(shù)后組織修復(fù)及TGF—β1和Smad3表達(dá)的影響

趙誠(chéng) 王未娟

[摘要]目的 通過(guò)研究肛瘺術(shù)后TGF-β1和Smad3因子的表達(dá)變化，了解紫草油促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制。方法 選取2017年3月～2018年3月我院收治的90例肛瘺患者作為研究對(duì)象，按照簡(jiǎn)單隨機(jī)方法分為紫草油組（30例）、膚痔清組（30例）與凡士林組（30例）。紫草油組采用紫草油外用方法，膚痔清組采用膚痔清外用，凡士林組采用凡士林外用。利用RT-PCR 和Western-blot檢測(cè)比較三組的TGF-β1和Smad3因子的表達(dá)情況。結(jié)果 RT-PCR 和Western-blot表明，紫草油組TGF-β1含量逐漸升高。治療后第21天，紫草油組中TGF-β1含量高于膚痔清及凡士林組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；治療后第21天，紫草油組中Smad3含量低于膚痔清及凡士林組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；同時(shí)紫草油組的愈合時(shí)間也短于其他兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 紫草油能夠有效促進(jìn)肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合，可能是通過(guò)上調(diào)TGF-β1含量及下調(diào)Smad3含量來(lái)調(diào)控的。可為紫草油治療濕熱下注型肛瘺術(shù)后提供了初步的理論基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]肛瘺；紫草油；TGF-β1；Smad3

[中圖分類(lèi)號(hào)] R657.1+6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）10（a）-0004-05

[Abstract] Objective To explore the mechanism of Arnebia Root Oil promoting wound healing by studying the expression changes of TGF-β1 and Smad3 factors after anal fistula surgery. Methods A total of 90 anal fistula patients admitted to our hospital from March 2017 to March 2018 were enrolled in this study. They were divided into the Arnebia Root Oil group （n=30）， Fuzhiqing group （n=30） and Vaseline group （n=30） according to the simple random method. In the Arnebia Root Oil group， Arnebia Root Oil was used， while in the Fuzhiqing group， Fuzhiqing for external application was used， and in the Vaseline group， Vaseline for external application was adopted. Expression of TGF-β1 and Smad3 factors among three groups was compared and detected by reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） and Western blot. Results RT-PCR and Western blot showed that the content of TGF-β1 in the Arnebia Root Oil group increased gradually. On the 21st day after treatment， the content of TGF-β1 in the Arnebia Root Oil group was higher than that in the Fuzhiqing and Vaseline groups with statistical significances （P<0.05）. On the 21st day after treatment， the content of Smad3 in the Arnebia Root Oil group was lower than that in the Fuzhiqing and Vaseline groups， which differed statistically （P<0.05）. Meanwhile， the healing time in the Arnebia Root Oil group was shorter compared with that of the other two groups （P<0.05）. Conclusion Arnebia Root Oil can effectively promote wound healing after anal fistula surgery， which may be regulated by TGF-β1 up-regulation and Smad3 down-regulation， thus providing a preliminary theoretical basis for Arnebia Root Oil treatment after anal fistula surgery identified as a damp-heat pouring downward pattern.

[Key words] Anal fistula； Arnebia Root Oil； TGF-β1； Smad3

肛瘺是肛管直腸與肛門(mén)周?chē)つw相連通的一種病理通道，是肛周膿腫的慢化階段，其臨床表現(xiàn)特點(diǎn)主要為肛門(mén)硬結(jié)、壓痛、反復(fù)局部流膿、潮濕及瘙癢。紫草油多年臨床驗(yàn)證它能促進(jìn)創(chuàng)面愈合，然其作用機(jī)制不明。TGF-β1/Smad3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程扮演著重要的角色。所以為闡明紫草油的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)以TGF-β1和Smad3因子為研究對(duì)象，檢測(cè)TGF-β1和Smad3 因子表達(dá)水平的變化。

1資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2017年3月～2018年3月收治的90例肛瘺患者作為研究對(duì)象，均簽署知情同意書(shū)。本研究已經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。按照簡(jiǎn)單隨機(jī)方法分為紫草油組（30例）、膚痔清組（30例）與凡士林組（30例）。紫草油組中，男19例，女11例；平均年齡（45.22±11.01）歲。膚痔清組中，男17例，女13例；平均年齡（43.02±10.21）歲。凡士林組中，男18例，女12例；平均年齡（44.62±09.51）歲。三組的性別、年齡等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性

1.2 診斷及入選標(biāo)準(zhǔn)

按照2006年出版的《肛瘺臨床診治指南（2006版）》[1]，選取低位單純性肛瘺作為研究對(duì)象。所有病例均在局麻下行“肛瘺切開(kāi)術(shù)”。

1.3研究方法

1.3.1 血清的提取 各實(shí)驗(yàn)組于手術(shù)后第1、7、14、21天次日抽取外周靜脈血3～5 ml，離心機(jī)離心后吸取上層血清至1.5 ml EP管保存。

1.3.2 RT-PCR法 按試劑盒操作程序提取總RNA并檢測(cè)，之后進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)。目的基因引物： TGF-β1上游引物序列為5′-AAGGACCTGGGTTGGAAGTG-3′，下游引物序列為5′-CCGCTTCCTTTGTCCATCAG -3′（擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度：381 bp）。Smad3基因的上游引物序列為5′-AGTTTGACGGTGAGCTGGTA-3′，下游引物序列為5′-GCCTCGGCCTGCCGCAAGCCT-3′（擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度：364 bp）。內(nèi)參GAPDH序列為：上游5′-CACCGGGAAACCCATCACCA-3′，下游為5′- ACGCC AGTAGACTCCACGACAT -3′（擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度：96 bp）。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳，GoldViewTM染色，檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。

1.3.3 Western-blot法 裂解液提取總蛋白后取等量總蛋白。電泳分離后用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。將TGF-β1和Smad3一抗用封閉液稀釋1000倍；將封閉后的膜直接放入一抗工作液中，4℃反應(yīng)過(guò)夜。然后將二抗用1×TBST稀釋3000倍，將一抗反應(yīng)膜放入二抗中作用60 min。ECL試劑盒顯色，拍照，采用美國(guó)UVP分析儀器，對(duì)膠片進(jìn)行掃描，比較各組灰度變化

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩樣本之間采用t檢驗(yàn)，多樣本比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 TGF-β1和Smad3 mRNA在血清中的表達(dá)

TGF-β1 及Smad3 PCR擴(kuò)增曲線顯示，每條曲線均有明顯的指數(shù)擴(kuò)增期，表明PCR體系完好；TGF-β1 及Smad3 PCR產(chǎn)物的溶解曲線顯示各擴(kuò)增產(chǎn)物為特異性目的基因（圖1～2）。

2.2三組術(shù)后不同時(shí)間TGF-β1和Smad3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的比較

經(jīng)治療，肛瘺術(shù)后三組TGF-β1 mRNA的表達(dá)水平均有所升高。術(shù)后第21天紫草油組中的TGF-β1 mRNA表達(dá)高于凡士林組、膚痔清膏組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；同時(shí)術(shù)后第21天，紫草油組中的Smad3 mRNA表達(dá)低于凡士林組、膚痔清膏組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.3紫草油治療肛瘺術(shù)后TGF-β1、Smad3 蛋白表達(dá)水平的影響

術(shù)后第21天，紫草油組TGF-β1蛋白表達(dá)水平明顯高于凡士林組、膚痔清組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與之相反，Smad3 蛋白表達(dá)水平明顯低于凡士林組、膚痔清組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖3、表2）。

2.4三組病例創(chuàng)面愈合時(shí)間的比較

紫草油組的創(chuàng)面愈合時(shí)間短于膚痔清組及凡士林組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表3）。

3討論

肛瘺是肛腸科常見(jiàn)疾病。肛瘺亦稱(chēng)為肛管直腸瘺，是一種異常管道[2]。國(guó)外有學(xué)者[3]報(bào)道，每十萬(wàn)人口有86人罹患肛瘺，平均年齡38.3歲，男女比例為1.8∶1.0，年齡<15歲的患者多為男性。手術(shù)是肛瘺的主要治療方法，但由于特殊的病變部位，肛瘺術(shù)后一般不做縫合，創(chuàng)面大，容易感染，創(chuàng)面愈合緩慢，因此如何加快肛瘺術(shù)后創(chuàng)面修復(fù)就成為臨床研究的熱點(diǎn)[4-5]。中醫(yī)外治是最古老的治法之一，尤其對(duì)肛腸疾病，中藥制劑的外用能使藥性直達(dá)病所，比內(nèi)服更具有優(yōu)勢(shì)，故《醫(yī)說(shuō)源流》曰：“外科之證，最重外治”。肛門(mén)局部創(chuàng)面分泌物稠厚黃白等“濕”“熱”的特點(diǎn)。除此之外，肛瘺術(shù)后，經(jīng)脈受損，施術(shù)局部氣血阻滯，與濕熱相結(jié)，形成濕熱蘊(yùn)結(jié)，氣滯血瘀的病理狀態(tài)，采用清熱利濕、活血化瘀、消腫止痛之中藥，使?jié)駸岢鲅?，新血生，瘡瘍愈合。故如何運(yùn)用清熱利濕化瘀法于肛瘺術(shù)后關(guān)重要。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為通過(guò)中藥外用，能夠加速創(chuàng)面愈合，療效明確。主要因?yàn)橥ㄟ^(guò)中藥外用能促進(jìn)組織周?chē)募?xì)胞釋放相關(guān)生長(zhǎng)因子，導(dǎo)致創(chuàng)面氧自由基的量和活性降低，進(jìn)一步提高機(jī)體抗感染能力[6]。我院紫草油方以紫草為君，黃連為佐使。紫草味苦、甘，性寒。功效：活血、涼血、解毒透疹?！侗静菥V目》曰：“紫草，其功長(zhǎng)于涼血活血，利大小腸?！弊喜萃庥贸Ｕ{(diào)制成油膏，亦可以水濃煎用。治療癰疽腫毒多用于潰后，或用于各種慢性潰瘍，凡創(chuàng)面赤腫及滲出較多者用之可起清熱消腫、減少滲出之功效，從而可生肌長(zhǎng)肉，促進(jìn)潰瘍愈合。黃連味苦性寒，有清熱、瀉火解毒的功效。常用于濕熱證等，又解毒療瘡.以治癰疽腫毒.口舌生瘡等。二味共為君藥共奏清熱利濕、消腫止痛之功。

創(chuàng)面愈合就是一個(gè)復(fù)雜的修復(fù)過(guò)程，機(jī)體通過(guò)自身的再生能力，恢復(fù)創(chuàng)面表面的連續(xù)性和完整性。在這個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程中，涉及多種組織和修復(fù)細(xì)胞、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和胞外基質(zhì)成分以及各種調(diào)控因素的共同參與。肉芽的主要成分是新生的毛細(xì)血管床和成纖維細(xì)胞[7]。創(chuàng)面愈合的主要修復(fù)細(xì)胞為成纖維細(xì)胞，直接影響膠原合成和分泌，而合成的膠原又是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的主要部。研究也證實(shí)，TGF-β1/Smad 信號(hào)通路的調(diào)控作用與創(chuàng)面愈合是密不可分的[8]。

TGF-β1是創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中重要的細(xì)胞因子，TGF-β/Smad 信號(hào)通路重要的組成部分[9]。TGF-β1作為 TGF-β 細(xì)胞因子家族的一員，與創(chuàng)傷愈合緊密聯(lián)系[10-11]。TGF-β1不僅是成纖維細(xì)胞的強(qiáng)效趨化因子，也是一種抗炎細(xì)胞因子[12]。主要作用于炎癥及修復(fù)細(xì)胞，可產(chǎn)生細(xì)胞的趨化性遷移、抗炎等生物學(xué)效應(yīng)[13]。此外TGF-β是刺激創(chuàng)面肉芽組織形成最有效的細(xì)胞因子之一，而這一誘生過(guò)程是可逆的，可增加傷口組織抗張強(qiáng)度和促使血管新生，對(duì)表皮有明顯促進(jìn)愈合作用。相關(guān)研究[14]提示，TGF-β1/Smad 信號(hào)通路對(duì)血管正常結(jié)構(gòu)的維持有重要的作用。本實(shí)驗(yàn)研究中表明，三組藥物干預(yù)均能上調(diào)TGF-β1 mRNA及蛋白的表達(dá)，但術(shù)后第21天紫草油組中的TGF-β1 mRNA及蛋白表達(dá)明顯高于凡士林組、膚痔清膏組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示紫草油能有效促進(jìn)肛瘺術(shù)后創(chuàng)面的愈合，與紫草油外用作用于創(chuàng)面后上調(diào)TGF-β1 mRNA有密切的關(guān)系。

Smad蛋白家族是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，直接參與TGF-β超家族成員TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）等多個(gè)成員的信號(hào)傳導(dǎo)[15]。Smad2與Smad3 屬于共同介導(dǎo)性的Smad蛋白，是TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中特異的、起瓶頸作用的重要因子。然而真正反映TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的激活水平與強(qiáng)度的是磷酸化Smad3 表達(dá)水平[16-17]。因此相關(guān)研究表明提高磷酸化 Smad2、Smad3 表達(dá)水平，可激活潰瘍創(chuàng)面 TGF-β1/Smad3 信號(hào)通路，加速傷口的修復(fù)[18]。相關(guān)研究表明敲除Smad3后，促使Smad3 表達(dá)降低，創(chuàng)傷愈合明顯加速[19]。本實(shí)驗(yàn)研究中表明，三組藥物干預(yù)后Smad3表達(dá)逐漸下降。術(shù)后第21天紫草油組中的Smad3 mRNA及蛋白表達(dá)明顯低于凡士林組、膚痔清膏組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示紫草油能通過(guò)下調(diào)Smad3因子的表達(dá)，進(jìn)而有效促進(jìn)創(chuàng)面的愈合。

綜上所述，TGF-β1/Smad3信號(hào)通路可多方面調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及纖維化等過(guò)程[20]。本實(shí)驗(yàn)研究提示紫草油能促進(jìn)肛瘺術(shù)后創(chuàng)面的愈合及縮短愈合時(shí)間，可能通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中TGF-β1及Smad3 因子表達(dá)水平。因此如何根據(jù) TGF-β1/Smad3通路的變化規(guī)律，有針對(duì)性地進(jìn)行科學(xué)地調(diào)控，也是我們進(jìn)一步研究的難點(diǎn)。

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（收稿日期：2018-07-02 本文編輯：許俊琴）