明膠/聚己內(nèi)酯納米纖維電紡膜在組織工程中的應(yīng)用進(jìn)展

燕麗 鄭蕊 沈征宇

【提要】 天然高分子材料明膠（Gelatin，GT）和人工合成高分子材料聚己內(nèi)酯（Polycaprolactone，PCL），兩者都具有良好的生物相容性和可降解性，已被應(yīng)用于組織工程研究領(lǐng)域。然而，單一組分的GT和PCL材料存在諸多缺點(diǎn)。GT/PCL復(fù)合材料克服了單一組分支架存在的缺點(diǎn)，具有理化性能佳和組分優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)等特點(diǎn)，可應(yīng)用于構(gòu)建組織工程器官和修復(fù)組織損傷。本文對(duì)GT/PCL納米纖維電紡膜的特征及其在組織工程多個(gè)領(lǐng)域中的應(yīng)用研究現(xiàn)狀進(jìn)行系統(tǒng)性回顧。

組織工程中的支架材料提供類似于細(xì)胞外基質(zhì)的替代結(jié)構(gòu)，使得種子細(xì)胞能夠依附其上，并通過在特定環(huán)境下的培養(yǎng)，最終形成特定的器官或組織。在新生細(xì)胞外基質(zhì)的形成、沉積和構(gòu)形過程中，支架材料被逐漸降解，最終留下能夠恢復(fù)、維持或改善組織功能的重要器官或組織[1]。

生物支架材料可大致分為兩類：可降解性天然高分子材料和人工合成高分子材料?？山到庑蕴烊桓叻肿硬牧希缑髂z（Gelatin，GT）等，具有不引起炎癥和免疫排斥反應(yīng)，細(xì)胞相容性好等優(yōu)點(diǎn)，但不易加工，強(qiáng)度不夠，降解速率和組織再生的速度難以匹配[2]；人工合成高分子材料，如聚己內(nèi)酯（Polycaprolactone，PCL）等，強(qiáng)度和降解速度可調(diào)，整體結(jié)構(gòu)和表面設(shè)計(jì)合理，但生物相容性不佳，易引起排斥反應(yīng)[3]。

將天然和人工合成高分子材料復(fù)合，可克服單一組分的缺點(diǎn)，達(dá)到優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)并改進(jìn)理化性能。復(fù)合方法主要包括化學(xué)交聯(lián)[4]、光交聯(lián)[5]、熱交聯(lián)[6]、靜電紡絲技術(shù)等。靜電紡絲技術(shù)是通過高壓靜電場(chǎng)，將符合目標(biāo)組織化學(xué)和生物物理要求的組分交聯(lián)，制作亞微米至納米級(jí)的復(fù)合型支架的常用技術(shù)[7]，能制作納米級(jí)的超薄纖維，可模擬機(jī)體多種組織和器官的細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境；能造就高孔隙率，增大材料表面積/體積比，便于物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；可根據(jù)需求載入聚合物、無機(jī)物、生物大分子等，擴(kuò)大應(yīng)用范疇；方法簡(jiǎn)便、直接、成本較低[2]。

GT/PCL納米纖維電紡膜由GT和PCL交聯(lián)制備得到，以此為支架材料，已進(jìn)行了大量組織工程的相關(guān)研究。本文將從GT/PCL納米纖維電紡膜的特征及應(yīng)用等方面進(jìn)行綜述。

1 GT/PCL納米纖維電紡膜的特征

①相比于單純的GT和PCL，GT/PCL復(fù)合能提供更佳的親水性和細(xì)胞親和力，且該復(fù)合材料支架可不斷釋放GT蛋白分子，為細(xì)胞的附著和增殖創(chuàng)造良好的環(huán)境。②GT/PCL復(fù)合材料孔隙率佳，且GT在細(xì)胞培養(yǎng)過程中逐漸溶解，為細(xì)胞遷移提供了更多的空間。③GT/PCL復(fù)合材料強(qiáng)度較PCL降低，具有較好的伸展和變形特性，可使細(xì)胞進(jìn)入支架的深層，便于定植[8-9]。④相比于化學(xué)交聯(lián)法，GT/PCL納米纖維電紡膜在很大程度上避免了化學(xué)交聯(lián)劑的潛在細(xì)胞毒性[2]。

2 GT/PCL納米纖維電紡膜的應(yīng)用

GT/PCL納米纖維電紡膜孔隙率適宜、形態(tài)均勻、纖維空間排布良好，為細(xì)胞的增殖和分化提供良好的環(huán)境，能促進(jìn)細(xì)胞黏附和定植相關(guān)的生長(zhǎng)因子[10-11]，可激活分化早期的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路，促進(jìn)鼠源性誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞分化[12]。這些特征為其在組織工程領(lǐng)域中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

2.1 在血管組織工程中的應(yīng)用

GT/PCL納米纖維電紡膜結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）或干細(xì)胞可構(gòu)建組織工程微型血管。Ma等[13]將ECs與GT/PCL納米纖維電紡膜二維共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)ECs與材料復(fù)合良好，移行和增殖速率增加，能穩(wěn)定持續(xù)表達(dá)3種血管性重要標(biāo)志物：血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子-1、細(xì)胞間黏附因子-1以及血管細(xì)胞黏附因子-1。Kook等[14]構(gòu)建了GT/PCL納米纖維電紡膜與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（hUVECs）、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）共培養(yǎng)體系，ADSCs能通過胞間聯(lián)系和旁分泌作用促使hUVECs向ECs轉(zhuǎn)化并分泌更多的血管生成因子，促進(jìn)血管形態(tài)發(fā)生；經(jīng)GT/PCL納米纖維電紡膜的三維培養(yǎng)，可形成血管內(nèi)腔結(jié)構(gòu)。

2.2 在骨組織工程中的應(yīng)用

GT/PCL納米纖維電紡膜成分和力學(xué)性質(zhì)類似于骨組織，可用于構(gòu)建組織工程骨。Venogopal等[15]通過傅里葉變換紅外光譜學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，材料中含氨基酸基團(tuán)、磷酸鹽基團(tuán)和羰基基團(tuán)，均是成骨所必需的；力學(xué)測(cè)試顯示，電紡膜屈伸度良好，強(qiáng)度符合骨組織構(gòu)建要求。與單純PCL電紡膜相比，GT/PCL納米纖維電紡膜的大孔隙率顯著增加了表面積，為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)提供了充足空間，膜上成骨細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，增殖率、堿性磷酸酶活性、骨分化程度均顯著增加。Guo等[16]研究發(fā)現(xiàn)，GT/PCL納米纖維空間方向性越一致、纖維延長(zhǎng)率越高、排列越趨于均質(zhì)，材料力學(xué)性能越好，成骨細(xì)胞種入后增殖率和堿性磷酸酶活性也越強(qiáng)。

2.3 在軟骨組織工程中的應(yīng)用

軟骨組織主要是由軟骨細(xì)胞和包含II型膠原、蛋白聚糖和其他糖胺聚糖的細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，其抗壓和抗拉力強(qiáng)度主要由細(xì)胞外基質(zhì)成分提供[17]。利用脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)結(jié)合軟骨細(xì)胞構(gòu)建組織工程軟骨十分困難。脫細(xì)胞軟骨基質(zhì)的細(xì)胞殘留和低孔隙率易導(dǎo)致免疫排斥和軟骨形成不完全[18]。GT/PCL納米纖維電紡膜制備簡(jiǎn)單，成本較低，且能促進(jìn)軟骨三維結(jié)構(gòu)的形成。Xue等[19]將軟骨細(xì)胞接種于GT/PCL納米纖維電紡膜，經(jīng)過2周的體外培養(yǎng)獲得類軟骨組織，而后將其接種在鈦合金耳郭模型上，移植至裸鼠皮下培養(yǎng)6周，可形成組織工程耳郭形狀軟骨，彈性和機(jī)械強(qiáng)度良好。Zheng等[20]就不同質(zhì)量比例的GT/PCL對(duì)三維軟骨再生的影響進(jìn)行研究，各組均具有良好的軟骨細(xì)胞相容性。低PCL質(zhì)量比例組 （GT∶PCL=70∶30）材料親水性更強(qiáng)，軟骨細(xì)胞分布更均勻，細(xì)胞外基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)滲透更佳，柱狀三維軟骨結(jié)構(gòu)早期形成情況更好，最終形態(tài)結(jié)構(gòu)更為均質(zhì)。對(duì)于精細(xì)且凹凸不平的耳軟骨再生模型，僅低PCL組在移植體內(nèi)12周后能夠完全形成形態(tài)和彈性類似于的軟骨結(jié)構(gòu)。

2.4 在神經(jīng)組織工程中的應(yīng)用

GT/PCL納米纖維電紡膜能夠促進(jìn)神經(jīng)纖維的生長(zhǎng)和促進(jìn)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化。Ghasemi-Mobarakeh等[21]將GT/PCL納米纖維電紡膜與神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞分化和增殖、神經(jīng)纖維的增長(zhǎng)和神經(jīng)根形成，相比單純PCL組均有顯著增加。Li等[22]證實(shí)GT/PCL納米纖維電紡膜不僅能促進(jìn)神經(jīng)元再生，還能作為不含神經(jīng)元的支架模型促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞軸突髓鞘形成。Karbalaeimahdi等[23]將GT/PCL納米纖維電紡膜用于誘導(dǎo)人多能性干細(xì)胞（hiPSC）向神經(jīng)細(xì)胞分化。發(fā)現(xiàn)hiPSC接種入膜后，經(jīng)神經(jīng)細(xì)胞分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基孵育，hiPSCs幾乎全部向神經(jīng)細(xì)胞方向分化，分化率顯著高于培養(yǎng)皿誘導(dǎo)分化組。

2.5 在皮膚組織工程中的應(yīng)用

皮膚移植存在來源不足、免疫排斥等問題，皮膚組織工程為此提供了新的解決方案[24]。

GT/PCL納米纖維電紡膜能夠促進(jìn)皮膚傷口愈合，并通過負(fù)載生長(zhǎng)因子加速這一過程。Tigli等[25]將表皮生長(zhǎng)因子（EGF）用化學(xué)共軛法連接在GT/PCL納米纖維電紡膜上，再將鼠L929成纖維細(xì)胞接種在單純材料組和負(fù)載EGF組上，結(jié)果顯示負(fù)載組細(xì)胞增殖明顯加快，傷口愈合更為完全。

2.6 作為生物活性物質(zhì)載體的應(yīng)用

生物活性物質(zhì)提供營(yíng)養(yǎng)、抵抗不良因素，促進(jìn)種子細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化等。但難以長(zhǎng)期穩(wěn)定存在[26]。GT/PCL納米纖維電紡膜能夠結(jié)合并包裹生物活性物質(zhì)，使之在可控條件下釋放和發(fā)揮作用。它能通過結(jié)合相關(guān)生長(zhǎng)因子促進(jìn)組織器官修復(fù)[25，27－28]，還能用于藥物的負(fù)載。 Xue 等[29]將甲硝唑溶于 GT/PCL混合液后進(jìn)行混紡，雖然最初3天內(nèi)仍有井噴式釋放現(xiàn)象，但在接下來的3周內(nèi)保持穩(wěn)定而持續(xù)的緩釋，培養(yǎng)皿厭氧菌培養(yǎng)結(jié)果顯示細(xì)菌定植減少。當(dāng)甲硝唑的濃度控制在30%以下時(shí)不表現(xiàn)細(xì)胞毒性，細(xì)胞能很好的黏附和定植在膜上。家兔體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，載MNA的GT/PCL納米纖維電紡膜進(jìn)入體內(nèi)炎癥反應(yīng)小，降解速率適宜，機(jī)體感染率降低。Zhu等[30]將不同藥物含量（1%、2%、4%）的 7-乙基-10-羥基喜樹堿（SN-38）與GT/PCL進(jìn)行混合電紡，體外藥物釋放試驗(yàn)表明，1%和4%含量的SN-38藥物釋放參數(shù)呈Fickan擴(kuò)散，而2%含量的SN-38最符合Korsmeyer藥代動(dòng)力學(xué)模型，即緩釋態(tài)勢(shì)最佳，并顯現(xiàn)出良好的生物可降解性和抗腫瘤作用。

2.7 在其他領(lǐng)域的應(yīng)用

GT/PCL納米纖維電紡膜可被用于研究腫瘤進(jìn)程。Hartman 等[31]將串珠素Ⅳ區(qū)（Perlecan domain IV，PlnDIV）蛋白聚糖與GT/PCL納米纖維電紡膜結(jié)合，其理化性質(zhì)與骨髓微環(huán)境相似，成功建立了前列腺癌骨轉(zhuǎn)移模型。接種前列腺癌細(xì)胞5 d后，觀察到癌細(xì)胞黏附、滲入、增殖和應(yīng)力纖維產(chǎn)生均顯著增加，緊密連接蛋白表達(dá)減少，黏著斑激酶（FAK）酪氨酸397位點(diǎn)磷酸化增加，使得癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移更為容易。

GT/PCL納米纖維電紡膜在口腔組織工程中也有很好的應(yīng)用前景。Kim等[32]將PDL干細(xì)胞和GT/PCL納米纖維電紡膜共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞按纖維方向排列，細(xì)胞特異性標(biāo)記（如骨膜素和腱生蛋白）表達(dá)增加，骨形成標(biāo)志物下調(diào)，說明PDL干細(xì)胞表型向韌帶方向轉(zhuǎn)化。

3 展望

綜上所述，GT/PCL納米纖維電紡膜具有眾多優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于組織工程領(lǐng)域。新興技術(shù)的不斷出現(xiàn)，也使GT/PCL納米纖維電紡膜具有了更廣的應(yīng)用范疇。相信通過不懈努力，GT/PCL納米纖維電紡膜的應(yīng)用前景會(huì)更加廣闊。