結(jié)核病病原學(xué)診斷評(píng)價(jià)方法探討
——與《結(jié)核病病原學(xué)分子診斷專家共識(shí)》作者商榷

楊蕾 王國治 盧錦標(biāo)

如何更好地利用分子生物學(xué)診斷報(bào)告服務(wù)臨床診斷，是困擾臨床工作者的難題。為此，中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)臨床檢驗(yàn)專業(yè)委員會(huì)組織實(shí)驗(yàn)室和臨床領(lǐng)域的專家對(duì)分子生物學(xué)診斷技術(shù)領(lǐng)域的重要問題進(jìn)行了討論，撰寫了《結(jié)核病病原學(xué)分子診斷專家共識(shí)》(簡稱“《共識(shí)》”)[1]，并刊于《中華結(jié)核和呼吸雜志》2018年第41卷第9期。該《共識(shí)》有助于臨床工作者與結(jié)核診斷試劑研究人員更好地理解最新2017版《WS288—2017 肺結(jié)核診斷》的診斷標(biāo)準(zhǔn)，以及提高結(jié)核病診療人員對(duì)分子生物學(xué)診斷技術(shù)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的解讀能力。但筆者對(duì)《共識(shí)》中分子診斷與微生物病原學(xué)診斷的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)與評(píng)價(jià)結(jié)果存在疑義，望與專家探討。

《共識(shí)》[1]認(rèn)為：“目前已有的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)中，不同檢測(cè)技術(shù)的最低檢出限值存在較大差異：GeneXpert方法為131 CFU/ml(注：“CFU”為“菌落形成單位”)，MTB培養(yǎng)為100 CFU/ml，其他分子生物學(xué)檢測(cè)方法為101～103CFU/ml，臨床標(biāo)本涂片為103～104CFU/ml。因此，臨床檢測(cè)標(biāo)本時(shí)，任何一種分子生物學(xué)檢測(cè)方法結(jié)果陽性、細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法陰性時(shí)，應(yīng)以分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果為準(zhǔn)，視為MTB陽性?！痹撏普撍玫姆肿釉\斷的評(píng)價(jià)方法不夠合理，細(xì)菌學(xué)診斷提供的數(shù)據(jù)有明顯錯(cuò)誤[2]，以不合適的論據(jù)推出的結(jié)論既不嚴(yán)謹(jǐn)也不可能準(zhǔn)確。

1. 以CFU為基數(shù)計(jì)算敏感度不妥。結(jié)核病分子診斷無論死菌或活菌均可檢測(cè)出陽性結(jié)果，因此，以CFU為基數(shù)計(jì)算敏感度遺漏了死菌可能產(chǎn)生的陽性結(jié)果，分子診斷實(shí)際檢測(cè)細(xì)菌個(gè)數(shù)多于培養(yǎng)出的CFU數(shù)，導(dǎo)致計(jì)算的檢出率虛高。依據(jù)本室檢測(cè)，以結(jié)核分枝桿菌PCR檢測(cè)試劑盒用國家參考品最低檢出量參考品為參照，GeneXpert方法最低檢出量為1×103個(gè)菌/ml～1×104個(gè)菌/ml，高于用CFU/ml描述的數(shù)值。

2.以CFU/ml為分子診斷檢測(cè)評(píng)價(jià)單位時(shí)不合理的另外一個(gè)原因。CFU是菌落形成單位。1個(gè)菌落可以由1個(gè)菌形成，也可以由成百上千個(gè)結(jié)核分枝桿菌組成的菌團(tuán)形成。結(jié)核分枝桿菌本身就呈分枝狀生長，研磨過細(xì)可能導(dǎo)致菌體死亡；研磨太粗則形成菌團(tuán)的可能性大增，而菌團(tuán)則會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果虛高。

3.任何檢測(cè)試劑要達(dá)到100%的特異度幾乎不可能，分子診斷技術(shù)難以完全克服污染的問題?！豆沧R(shí)》中提到等溫(恒溫)擴(kuò)增技術(shù)：“敏感度高但特異度相對(duì)較低，對(duì)防污染措施要求嚴(yán)格，其自動(dòng)化程度越高，檢測(cè)結(jié)果可信度越高[1]。”顯然，簡單認(rèn)定“分子生物學(xué)檢測(cè)方法結(jié)果陽性、細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法陰性”時(shí)必須認(rèn)可“分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果”是有缺陷的。

4. 《共識(shí)》[1]提供細(xì)菌學(xué)診斷的敏感度為“MTB培養(yǎng)為100 CFU/ml”，但該處所引的文獻(xiàn)依據(jù)實(shí)際提供的數(shù)據(jù)是“培養(yǎng)法的敏感度明顯高于涂片法，該方法可檢出10個(gè)細(xì)菌/ml[2]”。理論上，所有結(jié)核病分子診斷都需一定數(shù)量的起始菌方可檢出，但培養(yǎng)基中接種上1個(gè)活菌就能生長，并且采用膜過濾集菌方式、液體培養(yǎng)等方法還能進(jìn)一步提高活菌檢出率。正常情況下，培養(yǎng)的檢出敏感度要求需高于100 CFU/ml?！豆沧R(shí)》引用文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)[2]提示：培養(yǎng)法的檢出敏感度要求要高于《共識(shí)》提供的分子診斷法。高檢出敏感度要求的方法“細(xì)菌培養(yǎng)”未檢出，并不能排除低檢出敏感度要求的方法“分子診斷”檢出的陽性是假陽性的可能。

5.分子診斷技術(shù)的特異度易受多種因素的影響，不僅僅與標(biāo)本處理和實(shí)驗(yàn)室交叉污染有關(guān)，還與檢測(cè)機(jī)理、檢測(cè)靶標(biāo)的特異性、引物設(shè)計(jì)、擴(kuò)增次數(shù)的設(shè)置、陽性判斷值灰區(qū)值的設(shè)置等都有關(guān)?，F(xiàn)在商業(yè)化試劑的防污染措施和陰性對(duì)照僅能排除某些非結(jié)核分枝桿菌假陽性和交叉污染的影響。一般來說，不同分子生物學(xué)方法檢測(cè)的特異度不同，檢測(cè)結(jié)果的可信度也不同。

綜上所述，《共識(shí)》提出“任何一種分子生物學(xué)檢測(cè)方法結(jié)果陽性、細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法陰性時(shí)，應(yīng)以分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果為準(zhǔn)，視為MTB陽性”的結(jié)論無法成立。

事實(shí)上，我們并不排除細(xì)菌學(xué)檢測(cè)陰性分子生物學(xué)檢測(cè)陽性的結(jié)果多數(shù)是正確的診斷。但是，其原因與分子診斷方法無論死菌或活菌都能得出相同的結(jié)果提高了核酸陽性檢出率有關(guān)，與培養(yǎng)方法本身受條件與技術(shù)限制影響了培養(yǎng)陽性檢出率有關(guān)，卻與專家組提出的證據(jù)無關(guān)。建議專家重新收集、整理匯總國內(nèi)外研究的相關(guān)數(shù)據(jù)并修訂上述結(jié)論。

同時(shí)，應(yīng)認(rèn)識(shí)到，與其他方法學(xué)診斷一樣，除了要關(guān)注檢測(cè)方法的時(shí)效性、簡便性與自動(dòng)化程度外，病原生物學(xué)診斷最關(guān)鍵的依然是方法檢測(cè)結(jié)果的“敏感度”與“特異度”。就結(jié)核病病原學(xué)分子診斷而言，由于不同分子診斷技術(shù)的機(jī)理不一樣，各廠家研發(fā)技術(shù)水平不同，不同檢測(cè)試劑的敏感度與特異度有很大差異。

本室對(duì)國內(nèi)已經(jīng)批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床的結(jié)核病病原學(xué)分子診斷試劑用同一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢測(cè)的結(jié)果表明，敏感度最高的檢測(cè)試劑在10個(gè)菌/ml時(shí)即可檢出，敏感度最低的檢測(cè)試劑需要104個(gè)菌/ml時(shí)才能檢出。據(jù)最新發(fā)表的數(shù)據(jù)，專家認(rèn)可的檢測(cè)敏感度高的檢測(cè)試劑及方法，如：Xpert MTB/RIF Ultra，盡管敏感度較前一代產(chǎn)品有所提升[3]，但對(duì)培養(yǎng)陽性標(biāo)本檢測(cè)的陽性率也只有88%[4]。

建議《共識(shí)》撰寫專家組對(duì)不同試劑盒敏感度的差異是否會(huì)影響臨床檢測(cè)結(jié)果、目前結(jié)核病分子診斷學(xué)與細(xì)菌學(xué)檢測(cè)結(jié)果的關(guān)聯(lián)性提出指導(dǎo)性的意見，否則將無法滿足《共識(shí)》專家組提出的“提高結(jié)核病診療人員對(duì)分子生物學(xué)診斷技術(shù)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的解讀能力”的基本要求。我國各級(jí)結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)收治患者的陽性檢出率不一，在分子診斷與細(xì)菌培養(yǎng)敏感度相當(dāng)?shù)那闆r下，“肺結(jié)核患者病原學(xué)陽性率達(dá)到50%以上[5]”的目標(biāo)恐難以實(shí)現(xiàn)。