數(shù)字PCR技術(shù)及其應(yīng)用

楊 茜

（大連醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116044）

1985年K.Mullis發(fā)明的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（polymerase chain reaction，PCR），可以在體外模擬體內(nèi)核酸的合成過程，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期、降低科研成本，是生命科學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)革命性壯舉。但傳統(tǒng)的PCR技術(shù)也有弊端，僅能進(jìn)行半定量測定，在分析產(chǎn)物時(shí)需要進(jìn)行開蓋操作，容易產(chǎn)生假陽性[1]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，能夠?qū)崟r(shí)定量檢測核酸的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（quantitative PCR，qPCR）、數(shù)字PCR技術(shù)（digital PCR，dPCR）也相繼出現(xiàn)，一舉攻克傳統(tǒng)PCR的技術(shù)難題。而數(shù)字PCR憑借其高通量、高準(zhǔn)確度的特點(diǎn)，有著極為廣泛的應(yīng)用前景[2]。

1 數(shù)字PCR技術(shù)的原理

數(shù)字PCR技術(shù)包括兩部分，PCR擴(kuò)增以及熒光信號(hào)分析。它的原理是將含有DNA模板的反應(yīng)體系稀釋分離成單分子，分配到大量的反應(yīng)單元中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，采集每個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)，有熒光信號(hào)記為1，無熒光信號(hào)記為0。通過陽性微滴的比例或泊松分布公式計(jì)算樣本的原始濃度或拷貝數(shù)，最終獲得結(jié)果[3]。

2 數(shù)字PCR技術(shù)分類

數(shù)字PCR的靈敏度取決于檢測器的靈敏度、PCR擴(kuò)增效率以及反應(yīng)單元的數(shù)目。根據(jù)反應(yīng)單元形成的不同方式，將PCR技術(shù)分為三類系統(tǒng)：

2.1 微反應(yīng)室數(shù)字

PCR是在不銹鋼芯上刻蝕了數(shù)以千計(jì)的微反應(yīng)室，同時(shí)也將每個(gè)反應(yīng)單元的體積從微升級(jí)降至納升級(jí)，提高了樣品同量，但需要借助高通量的自動(dòng)點(diǎn)樣儀，提高了儀器成本和操作復(fù)雜性[4]。

2.2 微流控芯片數(shù)字

PCR是建立在微流體技術(shù)、納米制造技術(shù)和微電子技術(shù)等發(fā)展之上的，它的出現(xiàn)為我們提供了一個(gè)實(shí)現(xiàn)低成本、小體積和高通量PCR分析的理想平臺(tái)[5]。

2.3 液滴數(shù)字

PCR系統(tǒng)是在擴(kuò)增之前進(jìn)行微滴化處理，以極低的濃度包裹于油水兩項(xiàng)形成的數(shù)萬個(gè)納升至皮升級(jí)液滴中，每個(gè)液滴都是一個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)體系，擴(kuò)增后的產(chǎn)物富集在磁性微球上，破乳后收集進(jìn)行測序[6]。該技術(shù)的優(yōu)勢在于，能夠把不同模板的DNA分隔在不同的乳液中，避免了引物與引物之間、不同產(chǎn)物之間的相互影響[7]。同時(shí)可以在不同的反應(yīng)室中進(jìn)行同時(shí)擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了高通量測定。

3 數(shù)字PCR技術(shù)應(yīng)用

3.1 病原微生物的檢測

目前醫(yī)院主要通過qPCR對血液、腦脊液等臨床樣本進(jìn)行病原微生物的檢測，但qPCR仍存在較多缺點(diǎn)：不同實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)品或者對照品之間存在誤差，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室內(nèi)或者不同實(shí)驗(yàn)室之間qPCR的檢測結(jié)果有差異，需建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)曲線[2]；Yan[8]等采取感染H7N9的患者十個(gè)不同治療時(shí)期的樣本，分別進(jìn)行qPCR及dPCR檢測，發(fā)現(xiàn)對于qPCR陰性的樣本，dPCR仍可以檢測出病毒的存在，說明dPCR的靈敏度遠(yuǎn)高于qPCR。數(shù)字PCR不僅可以對病原體定性，而且還能對病原體DNA或RNA序列進(jìn)行絕對定量，從而對疾病進(jìn)行早期診斷、藥物療效觀察、病情判斷及預(yù)后觀察，目前數(shù)字PCR技術(shù)已廣泛的應(yīng)用于HBV、HIV、甲型流感病毒等臨床領(lǐng)域[9]。

3.2 腫瘤診斷

許多腫瘤早期就出現(xiàn)癌基因的突變和表達(dá)異常，dPCR技術(shù)不僅能有效地檢測到癌基因的突變，而且可以準(zhǔn)確定量其表達(dá)。如肺癌表皮生長因子受體、神經(jīng)膠質(zhì)瘤異檸檬酸脫氫酶及葡萄膜黑色素瘤突變的檢測[9]。miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們在動(dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，其與癌癥也密切相關(guān)[10]。田輝等人[11]建立了一種基于連接反應(yīng)的微滴式數(shù)字PCR檢測單細(xì)胞中miRNA，這與研究與miRNA有關(guān)的疾病有著重要的意義。

3.3 產(chǎn)前診斷

產(chǎn)前診斷可以在出生前對胎兒的發(fā)育狀態(tài)、患有的疾病等方面進(jìn)行檢測。傳統(tǒng)的侵入方法如羊水穿刺和絨毛取樣，存在讓孕婦流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)[10]。1997年，LO[12]發(fā)現(xiàn)了存在于孕婦外周血的胎兒游離的cffDN A，為無創(chuàng)產(chǎn)前診斷提供了新的思路。2017年，LO[13]利用數(shù)字PCR進(jìn)行了cffDNA的異常分析，用于21三體綜合征的診斷，上述方法可檢測血液中25%的胎兒基因。Barrett[14]利用cffDNA進(jìn)行了鐮狀紅細(xì)胞貧血的檢測。

dPCR作為一項(xiàng)新的技術(shù)，還存在許多問題需要解決和探討。相信隨著科技的進(jìn)步與技術(shù)的革新，該技術(shù)定將廣泛的應(yīng)用在生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。