電穿孔現(xiàn)象與不可逆電穿孔治療晚期進(jìn)展期胰腺癌的研究進(jìn)展

史秋生，杜聯(lián)芳，張焱鋒

上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，上海 201620

胰腺癌發(fā)病隱匿，進(jìn)展快，確診時(shí)已多屬晚期。文獻(xiàn)報(bào)道，胰腺癌1年生存率為27%，5年生存率為5%～6%，伴有轉(zhuǎn)移者預(yù)期生存期僅2.8～5.7個(gè)月［1］。除手術(shù)和放化療外，射頻消融等是常用的局部治療方法，但組織破壞缺乏選擇性，易損傷鄰近重要結(jié)構(gòu)而引起嚴(yán)重并發(fā)癥［2-3］。不可逆電穿孔（irreversible electroporation，IRE）是一種細(xì)胞消融新技術(shù)，已取得令人興奮的臨床前期研究結(jié)果，在晚期進(jìn)展期胰腺癌中的臨床治療中也收獲頗豐，現(xiàn)綜述如下。

1 電穿孔現(xiàn)象

20世紀(jì)60年代早中期，悉尼大學(xué)植物生理學(xué)Alex Hope實(shí)驗(yàn)室的Coster博士在研究珊瑚輪藻單細(xì)胞的電特性時(shí)發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞跨膜電位從-300 mV超極化向-50 mV除極化轉(zhuǎn)變過程中，細(xì)胞膜顯示了很好的整流性，當(dāng)超極化接近-400 mV時(shí)，電流瞬間增大而細(xì)胞活性不受影響。他描述了該現(xiàn)象并首次提出穿透效應(yīng)（punchthrough effect）這一術(shù)語［4］。之后，相似的穿透或電穿孔現(xiàn)象（punchthrough or electrical breakdown phenomenon or electroporation）也在其他黏附細(xì)胞及懸浮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中被觀察到［5］。

2 電穿孔物理學(xué)改變

Coster［5］發(fā)現(xiàn)，電穿孔時(shí)細(xì)胞膜的物理狀態(tài)不穩(wěn)定，示波器顯示振蕩狀態(tài)。Crowley［6］和Garcia等［7］認(rèn)為，相對(duì)于外加電場(chǎng)，脂質(zhì)雙分子細(xì)胞膜是一個(gè)巨大的彈性層，電場(chǎng)中的電應(yīng)切力（electric stress）或化學(xué)應(yīng)切力（chemical stress）會(huì)振動(dòng)并撕碎細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞破裂。Kinosita等［8］于1988年用亞微秒級(jí)的脈沖激光熒光顯微鏡觀察到，未受精的海膽卵細(xì)胞在臨界電場(chǎng)中，0.01%～0.10%面積的細(xì)胞膜呈“漏洞狀態(tài)”（leaky state）。Change等［9］于1990年首次用快速冷凍電子顯微鏡觀察處于高壓電場(chǎng)中的紅細(xì)胞，約20 ns后細(xì)胞表面出現(xiàn)火山口樣凹陷，直徑20～120 nm。2012年，Lee等

［10］用高壓電場(chǎng)作用于新西蘭兔與約克夏豬肝，掃描電子顯微鏡觀察到細(xì)胞表面存在微孔，大小80～490 nm，邊界清楚，呈圓形或凹陷狀。微孔大小分布不均勻，細(xì)胞兩極密度最高，近赤道部位孔徑最大，而對(duì)照肝細(xì)胞表面則無改變。電穿孔過程受脈沖幅度、持續(xù)時(shí)間及頻率影響。脈沖幅度決定電穿孔面積，持續(xù)時(shí)間和頻率主要影響微孔密度。Geng等［11］認(rèn)為，細(xì)胞像一個(gè)電容，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外液的導(dǎo)電性高于細(xì)胞膜數(shù)個(gè)數(shù)量級(jí)，因此處于電場(chǎng)中的細(xì)胞膜兩側(cè)瞬間會(huì)形成足夠大的跨膜電壓。超過臨界值時(shí)，膜上的脂質(zhì)分子結(jié)構(gòu)重排并形成納米級(jí)微孔。微孔大小和數(shù)量與細(xì)胞形狀、細(xì)胞膜厚度、導(dǎo)電性、電場(chǎng)方向和細(xì)胞中心角度有關(guān)。

3 電穿孔生物物理學(xué)改變

電穿孔現(xiàn)象發(fā)生時(shí)，細(xì)胞膜的通透性增強(qiáng)，平時(shí)不能進(jìn)入細(xì)胞的各種分子如熒光染料、DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白質(zhì)、多肽、藥物和納米顆粒等可進(jìn)入細(xì)胞或組織。去除電場(chǎng)影響后，上述活動(dòng)停止，細(xì)胞恢復(fù)正?；钚誀顟B(tài)，該過程稱可逆電穿孔（reversible electroporation），生物物理學(xué)變化包括彌散、對(duì)流、電泳、電滲透、胞飲、細(xì)胞膜分子結(jié)構(gòu)重排等多種假說［9,11］。去除電場(chǎng)影響后，細(xì)胞活性若不能恢復(fù)，最終會(huì)造成細(xì)胞死亡，該過程稱IRE，機(jī)制尚未完全闡明。有兩種假說：機(jī)電不穩(wěn)定性理論（electromechanical instability theory）［4-6］和微孔理論（pore theory）［9-11］。無論何種機(jī)制，IRE的生物物理學(xué)結(jié)果是細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平衡受到破壞，最終細(xì)胞死亡［7,11］。

4 IRE治療腫瘤的臨床前期研究

電穿孔概念被引入醫(yī)學(xué)界30多年來，一直聚焦于可逆電穿孔的基因與藥物遞送［12］。直到2005年，Miller等［13］體外研究證實(shí)，IRE可使人HepG2肝癌細(xì)胞發(fā)生完全細(xì)胞消融。Edd等［14］于2006年的體內(nèi)研究報(bào)道，IRE可使SD大鼠肝臟發(fā)生微血管閉塞，內(nèi)皮細(xì)胞壞死，大量紅細(xì)胞滲出肝竇，造成肝實(shí)質(zhì)缺血性損傷，但肝臟大血管結(jié)構(gòu)完整保存。肝細(xì)胞邊界模糊，胞質(zhì)蒼白，空泡變性或可復(fù)性致密化。Lee等［15］于超聲引導(dǎo)下用IRE消融35 kg約克夏豬肝臟，消融區(qū)與非消融區(qū)邊界十分清晰，肝細(xì)胞完全死亡，消融區(qū)周圍大血管結(jié)構(gòu)完好，實(shí)時(shí)超聲與大體病理測(cè)量相關(guān)性好?？笲ax抗體免疫組織化學(xué)分析提示，IRE引發(fā)的細(xì)胞死亡可能是程序性細(xì)胞死亡。2011年，Charpentier等［16］在剖腹?fàn)顟B(tài)下對(duì)豬肝門結(jié)構(gòu)進(jìn)行IRE消融，結(jié)果顯示IRE能完全消融肝蒂周圍肝臟組織，沒有附帶的膽管、肝動(dòng)脈和門靜脈損傷，肝細(xì)胞壞死即刻發(fā)生并延伸到大的中央靜脈邊緣。Onik等［17］對(duì)6只雄性獵犬前列腺進(jìn)行超聲引導(dǎo)IRE研究，其中一只犬的消融灶包括直腸、尿道和神經(jīng)血管束。結(jié)果顯示，從正常組織到完全壞死區(qū)，有一個(gè)狹窄的過渡區(qū)，消融區(qū)組織完全破壞，2周內(nèi)消融灶消退，邊界皺縮，尿道、血管、神經(jīng)和直腸等結(jié)構(gòu)不受影響。Deodhar等［18］對(duì)35～50 kg的15只雌性豬的腎臟進(jìn)行IRE研究，29個(gè)消融灶中有18個(gè)包含腎盂或腎盞。結(jié)果顯示，36 h內(nèi)腎皮質(zhì)完全壞死，腎盂上皮細(xì)胞壞死，尿道上皮細(xì)胞脫落，腎盂細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)完整；3周后腎皮質(zhì)纖維化，腎盂上皮細(xì)胞再生，未發(fā)現(xiàn)腎盂及血管損傷。Maor等［19］將IRE電場(chǎng)直接加于300～350 g雄性大鼠頸總動(dòng)脈，所有6只大鼠均能耐受，無明顯不良反應(yīng)。28 d觀察發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞層變薄，中層平滑肌細(xì)胞數(shù)量明顯減少，血管壁的連接層基質(zhì)完好，無假性動(dòng)脈瘤、血栓和壞死形成，無偏癱和截癱等腦血管事件發(fā)生。Charpentier等［20］于剖腹下將IRE電極插入豬胰腺組織內(nèi)，可形成邊界清晰的消融灶。José等［21］的胰腺導(dǎo)管癌裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)顯示，IRE后腫瘤細(xì)胞廣泛壞死，增生減緩，裸鼠生存期明顯延長(zhǎng)，僅有短暫性轉(zhuǎn)氨酶、淀粉酶、脂肪酶增高。

大量臨床前期研究表明，IRE具有很好的細(xì)胞消融效果，對(duì)血管、膽管、胰管、神經(jīng)束無熱損傷，血管周圍的消融灶無散熱（heat-sink）或冷卻效應(yīng)（cooling effect），在肝臟、胰腺、腎臟、前列腺等器官消融中未見嚴(yán)重并發(fā)癥。

5 IRE在晚期進(jìn)展期胰腺癌臨床治療中的進(jìn)展

2008年，美國食品藥品管理局（Food Drug and Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)IRE消融技術(shù)用于臨床腫瘤治療，主要是因?yàn)镮RE狀態(tài)下活體組織溫度仍不超過50 ℃，無散熱現(xiàn)象，不損傷血管、膽管等結(jié)締組織［12］。2012年，Bagla等［22］首次報(bào)道1例78歲不可切除胰腺癌，病灶大小40 mm并包繞腹腔動(dòng)脈和腸系膜上動(dòng)脈，經(jīng)皮IRE治療后3個(gè)月出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，后經(jīng)肝臟射頻消融及吉西他濱化療6個(gè)月，MRI顯示無殘留病灶，血清糖類抗原199（carbohydrate antigen 199，CA-199）明顯降低。同年，Narayanan等［23］報(bào)道無法手術(shù)切除或放化療后仍無法切除的晚期進(jìn)展期胰腺癌14例，病灶大小25～70 mm。IRE治療后即刻及24 h CT掃描顯示，所有患者消融區(qū)內(nèi)的血管結(jié)構(gòu)通暢。2例患者分別于消融后4個(gè)月和5個(gè)月進(jìn)行胰腺腫瘤切除，術(shù)后病理顯示切緣未發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞，無病生存期（disease-free survival，DFS）分別為11和14個(gè)月，未發(fā)生與操作過程直接相關(guān)的死亡。2014年，Mǎnsson等［24］報(bào)道無法切除或標(biāo)準(zhǔn)抗腫瘤治療后不適合化療或切除的胰腺導(dǎo)管癌5例，經(jīng)多學(xué)科團(tuán)隊(duì)評(píng)估后行超聲引導(dǎo)下IRE治療。治療后30 d超聲造影顯示，腫瘤病灶未見殘留。1例胰頭腫瘤包繞門靜脈，門靜脈恰好處于消融區(qū)內(nèi)，但超聲檢查顯示門靜脈未受損傷，3個(gè)月后CT復(fù)查病灶縮小，行胰十二指腸切除術(shù)，組織病理學(xué)檢查提示切口周圍無腫瘤細(xì)胞殘留。2例患者半年超聲造影和CT檢查均未顯示復(fù)發(fā)征象。1例發(fā)生亞臨床胰腺炎，胰腺淀粉酶及C反應(yīng)蛋白增高。3例發(fā)生白細(xì)胞和C反應(yīng)蛋白升高。術(shù)后患者有可耐受的腹痛，但無嚴(yán)重并發(fā)癥征象（Dindo-Clavien分級(jí)）。Martin等［25］的多中心研究報(bào)道了200例Ⅲ期胰腺癌患者，在誘導(dǎo)化療基礎(chǔ)上150例接受IRE，50例接受胰腺手術(shù)切除加IRE邊緣強(qiáng)化（margin enhancement）治療。結(jié)果顯示，37%患者有并發(fā)癥，級(jí)別中位數(shù)為2級(jí)（1～5級(jí)），總生存期中位數(shù)為24.9個(gè)月，提示IRE與放化療聯(lián)合應(yīng)用確實(shí)能延長(zhǎng)患者總生存期。Kluger等［26］單中心報(bào)道T4期胰腺癌患者50例53次IRE治療，其中29次為IRE原始治療（primary treatment），24次為邊緣擴(kuò)展（margin extension）治療。結(jié)果顯示，原始治療組中90 d死亡5例，邊緣擴(kuò)大治療組死亡1例。兩組均有5例發(fā)生3或4級(jí)并發(fā)癥，主要是上消化道出血、內(nèi)臟潰瘍和穿孔、門靜脈栓塞。

6 存在的問題與展望

IRE作為一種嶄新的腫瘤局部消融技術(shù)，一進(jìn)入臨床應(yīng)用階段即已呈現(xiàn)出廣闊的前景，并在棘手的胰腺癌治療中得以體現(xiàn)。然而，許多問題尚待深入探討：① 適應(yīng)證與治療方案選擇，包括治療途徑是選取經(jīng)皮、經(jīng)腹腔鏡還是剖腹直視下IRE消融，采用超聲、CT或MRI何種引導(dǎo)。② 治療效果評(píng)估體系建立：超聲造影、CT或MRI何時(shí)介入療效評(píng)估，以及臨床療效評(píng)估參數(shù)的設(shè)置。③ 如何在確保完全徹底消融胰腺腫瘤細(xì)胞的同時(shí)防止發(fā)生嚴(yán)重的并發(fā)癥。