高效液相色譜法測定杜仲黑茶中綠原酸和咖啡因的含量

朱冰

摘 要：建立高效液相色譜法測定杜仲黑茶中綠原酸和咖啡因的含量，以ZORBAX SB-C18 （250 mm × 4.6 mm i.d.，5μm）為色譜柱，0.4%醋酸水溶液和乙腈溶液為流動相進行梯度洗脫，流速0.8 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫25，綠原酸和咖啡因能得到較好的分離。在2.0～150.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)，綠原酸和咖啡因的峰面積和濃度呈良好的線性關(guān)系（r> 0.9990），精密度（RSD <2%）和準(zhǔn)確度（97.80%～101.44%）高。建立的高效液相色譜方法簡便、準(zhǔn)確，適合杜仲黑茶中綠原酸和咖啡因的含量分析。

關(guān)鍵詞：杜仲黑茶；綠原酸；咖啡因；高效液相色譜；質(zhì)量控制

中圖分類號：TS207.3 文獻標(biāo)識碼：A 收稿日期：2017-10-14

杜仲是我國傳統(tǒng)名貴中藥，杜仲葉和杜仲皮的功能活性成分相同：環(huán)烯醚萜類、苯丙素類、黃酮類和多糖類化合物[1][2]；同時具有類似的保健功效：抗高血壓、抗高血脂、抗菌、抗肥胖、抗氧化、保護神經(jīng)等[3][4][5]。由于杜仲皮供給緊張，杜仲葉資源豐富，因此杜仲葉的綜合開發(fā)利用前景廣闊，而杜仲茶是其中的典型代表。中國的制茶工藝多種多樣，杜仲黑茶是張家界茶坤緣生物科技開發(fā)有限公司研發(fā)的新產(chǎn)品，以杜仲葉和茶葉（8∶2， m/m）為原料混合，經(jīng)過殺青、渥堆發(fā)酵、蒸壓等工序制成?！吨腥A人民共和國藥典》確定綠原酸為杜仲葉藥材的主要藥用有效成分及其含量標(biāo)準(zhǔn)[6]。茶葉具有抗氧化、抗癌、降血糖、提高免疫等功效，茶多酚和咖啡因是茶葉中主要功效成分[7]。研究表明，黑茶的制備工藝會影響茶葉內(nèi)成分的含量變化，主要化學(xué)成分的含量不同程度地降低，而咖啡因是黑茶的特征功效之一，研究咖啡因的含量有助于更好地認識黑茶。鑒于此，建立杜仲黑茶中綠原酸和咖啡因的含量的檢測方法，可建立杜仲黑茶的質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)，保證杜仲黑茶的安全性和有效性[8]。但是，目前未見相關(guān)研究報道。

目前測定中藥或食品等中目標(biāo)化合物的方法主要為高效液相色譜法（High-

performance liquid chromatography， HPLC），簡單有效，選擇性高，重現(xiàn)性高且分離效率高。檢測器有質(zhì)譜檢測器和紫外檢測器，質(zhì)譜檢測器具有高靈敏度的特點，但是設(shè)備昂貴，難以推廣應(yīng)用；紫外檢測器對具有紫外吸收的化合物通用，靈敏度較高、重現(xiàn)性好。綠原酸和咖啡酸均具有紫外吸收，可使用紫外檢測器進行檢測。因此，本文擬建立高效液相色譜方法測定杜仲黑茶中綠原酸和咖啡因的含量，研究結(jié)果為杜仲黑茶活性成分的定量分析提供方法參考，同時為杜仲新型功能茶的開發(fā)提供事實依據(jù)。

一、實驗部分

1.儀器與試劑

安捷倫1260高效液相色譜儀（Agilent Technologies， Santa Clara， CA），包括四元泵、自動進樣器、恒溫箱和二極管陣列檢測器。

杜仲黑茶于2017年2月購自張家界茶坤緣生物科技開發(fā)有限公司。綠原酸和咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司。色譜純乙腈和乙酸購自美國飛世爾科學(xué)世界公司，其他分析純試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，水為超純水。

2.色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18 （250 mm × 4.6 mm i.d.，5μm）；預(yù)柱：菲羅門C18（4.0 mm×3.0 mm， Phenomenex， Torrance， CA）。流動相：溶劑A（0.4%醋酸水溶液）和溶劑B（乙腈），梯度洗脫過程為0～10 min，12% B；10～16 min，12%～18% B；16～40 min，18% B。流速：0.8 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：254 nm；進樣量：20 μL。

3.杜仲黑茶提取物溶液的制備

將杜仲黑茶干燥粉碎，精密稱取樣品10.00 g至圓底燒瓶中，用100 mL 75%的乙醇85 ℃回流提取三次，每次2 h，合并濾液過濾后減壓濃縮成浸膏，得到1.99 g粗提物。精密稱取0.10 g 粗提物，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，用0.45 μm濾膜過濾得供試品溶液（10.0 mg/mL）。

二、結(jié)果與討論

1.色譜條件的選擇及優(yōu)化

綠原酸的紫外掃描最大吸收波長為242，300（sh），325 nm；咖啡因的最大吸收波長為275 nm。為了同時靈敏地檢測綠原酸和咖啡因，選擇檢測波長為254 nm。

由于杜仲黑茶中化學(xué)成分結(jié)構(gòu)多樣，極性相差較大，因此試驗中采用梯度洗脫。醋酸能夠抑制多酚類化合物中酚羥基的離解，改善分離效果和峰型。比較甲醇和乙腈作為流動相時不同梯度洗脫程序下的HPLC譜圖發(fā)現(xiàn)，以乙腈作為流動相分離度較好，峰形對稱性高，無拖尾現(xiàn)象。因此，在流速為0.8 mL/min時，選用0.4%醋酸水溶液（A）和乙腈溶液（B）為流動相進行梯度洗脫： 0～10 min，12% B；10～16 min，12%～18% B；16～40 min，18% B。在此色譜條件下，綠原酸和咖啡因能達到基線分離，且基本不受其他雜質(zhì)峰影響，整個分離在40 min內(nèi)能夠完成，能滿足定量分析的要求，詳見HPLC色譜圖。通過與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間對比分析，主要化合物1和2被鑒定為綠原酸和咖啡因。

2.方法的線性范圍與檢出限

將混合對照品儲備液用乙腈稀釋成5個濃度系列的混合對照品標(biāo)準(zhǔn)工作液，在上述色譜條件下進行HPLC分析，記錄峰面積，以對照品濃度X （μg/mL）對其峰面積的平均積分值（Y）進行線性回歸，得回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)以及檢出限（S/N =3）（表1）。結(jié)果表明：綠原酸和咖啡因在2.0～150.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。endprint

3.方法的精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和回收率

對同一混合對照品溶液重復(fù)測定6次， 每次進樣20 μL，測定峰面積，得綠原酸和咖啡因的RSD分別為0.93 %、1.25 %，表明精密度良好；連續(xù)重復(fù)測定3天， 綠原酸和咖啡因峰面積的RSD分別為1.93 %、1.04 %，說明對照品溶液在3天內(nèi)穩(wěn)定性良好；對同批樣品分別制備混合對照品，測定綠原酸和咖啡因峰面積的RSD分別為1.42 %和1.69 %，表明同批次樣品重現(xiàn)性良好。

經(jīng)過測定，取綠原酸和咖啡因含量分別為76.02 μg/mL和135.10 μg/mL的杜仲黑茶溶液3份，每份各1 mL，分別加入濃度為100.00 μg/mL的混合對照品溶液1 mL、混合的2 mL溶液，分別進樣20 μL， 結(jié)果見表2，回收率97.80%～101.44%，說明加標(biāo)回收率良好，準(zhǔn)確度高。

4.樣品處理方法的考察

考察了不同濃度的甲醇或乙醇（50%， 75%， 95%）、不同溫度（70℃， 85℃， 95℃）、不同藥材-溶液比（1∶6， 1∶8， 1∶10， 1∶12），不同回流提取次數(shù)（1， 2， 3），每次回流提取時間（1h， 2h， 3h）對杜仲黑茶中綠原酸和咖啡因的提取影響。其中10.00 g杜仲黑茶，加入100 mL 75%的乙醇，在85 ℃時回流提取三次，每次2 h，杜仲黑茶的綠原酸和咖啡因提取率最高。

5.樣品檢測

測定樣品3次， 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出綠原酸和咖啡因的含量分別為4.54 ± 0.13mg/g和8.07 ± 0.25 mg/g。

三、結(jié)語

綠原酸和咖啡因是杜仲黑茶的主要成分，本實驗首次建立了HPLC法同時測定杜仲黑茶中綠原酸和咖啡因含量的方法，所建立的測定方法簡便、重復(fù)性好、精密度高，為杜仲黑茶的質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。

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