藍莓組培無菌系的建立研究進展

李有清， 梁稱福

(湖南環(huán)境生物職業(yè)技術學院 園林學院，湖南 衡陽 421000)

藍莓(VacciniumSpp)，杜鵑花科(Ericaeae)越橘屬(Vaccinium)多年生灌木.其小漿果類果實皮較薄，其果肉酸甜可口，是一種具有很好的保健作用的水果，發(fā)祥地和主要的生產(chǎn)地都在北美洲地區(qū).當前國內(nèi)外的藍莓主栽品種為高叢(Vacciniumcorymbosum)，矮叢(Vacciniumangustifolium)，兔眼(Vacciniumashei)三種.一方面，藍莓果實中包含了許多種類活性功能成分，比如花色素苷、黃酮等物質(zhì)，這些活性物質(zhì)能夠起到預防腦神經(jīng)衰老[1]、糖尿病等疾病發(fā)生的功效，同時又能增強心臟功能；另一方面，相關研究已經(jīng)證明，藍莓在眼疾和癌癥等疾病的預防上也具有很好的功效[2，3].藍莓因其極好的保健治療功能，在國際國內(nèi)都具有較好的聲譽[4].作為具有良好保健作用的水果之一，藍莓的廣泛栽培在二十一世紀具有很好的經(jīng)濟效益，能為解決農(nóng)民增收問題提供一個比較穩(wěn)定的產(chǎn)業(yè)項目[5].

二十世紀八十年代后期我國開始對藍莓進行引種馴化[6].一直以來，藍莓果實及其各種加工產(chǎn)品在海內(nèi)外十分暢銷，各大市場上的藍莓產(chǎn)品都存在很大的需求缺口[7].就市場上受歡迎度較高的兔眼藍莓來說，在我國除了江蘇、浙江和貴州等幾個省具備較大規(guī)模的集中栽培外，兔眼藍莓在我國南方許多地區(qū)仍然還在進行引種試種的栽培適應性研究[8].由于藍莓扦插繁殖系數(shù)較低，且扦插后生根速度慢，還有較高的概率攜帶病毒，不利于擴大藍莓的栽培面積，常見的扦插繁殖方式很難滿足國內(nèi)市場對藍莓種苗的需求[9].而利用植物組織培養(yǎng)技術需要的繁殖材料較少且繁殖系數(shù)較高，可以使用這種方法以快速繁殖種苗從而緩解目前苗木市場供應困難的局面[10].同時，我國學者近年來在藍莓組培技術上的應用研究已取得一定的成果.該文擬從藍莓組培無菌系建立的角度，分外植體的取材、滅菌方法和培養(yǎng)基的選擇三個部分進行綜述，以期整理目前為止國內(nèi)無菌系建立的方法、成果，為藍莓組培的進一步系統(tǒng)的發(fā)展提供思路及數(shù)據(jù)支持.

1 外植體的取材

在植物的組織培養(yǎng)當中，外植體的選擇是否合適會在很大程度上影響初代培養(yǎng)的成功率.已有的研究表明，在選取材料部位上，在取材時間的確定上，外植體的存活率都會受到極大的影響.

1.1 取材部位

在藍莓組培應用的研究中，學者們試驗了藍莓種子、休眠枝條、葉片和莖段或莖尖作為外植體的萌芽率、存活率、生根率等情況；而在實際的生產(chǎn)過程中，則通常會使用藍莓當年萌發(fā)的帶腋芽的莖段或頂芽作外植體[11].之所以如此，主要是由于選擇莖段或頂芽作外植體具有操作簡單，成活率和增殖率高，且可以保持相關藍莓品種的種性等優(yōu)勢[12].另一方面，在國外，則使用藍莓葉片作外植體做研究或生產(chǎn)實踐所占比例較大[13].

國內(nèi)使用各品種藍莓莖段作為外植體的研究結果均表明，莖段適宜于用作藍莓組培外植體材料.涂俊凡等[14]、沙玉芬等[15]和張凱等[16]以都克藍莓為對象的研究表明，采用莖段作為外植體，都克藍莓的萌芽率都達到80%以上.趙興宇等[11]以大興安嶺野生藍莓莖段作為外植體，同樣有80%的莖段形成了愈傷組織.近幾年也有使用其它部位作外植體的研究報道.陽翠等[12]等使用萊格西藍莓品種一年生枝條做外植體，結果表明萌芽率能達到92.47%.

1.2 取材時間

研究發(fā)現(xiàn)，田間材料的取材時間對能否成功建立藍莓離體培養(yǎng)體系也存在很大的影響.在藍莓離體培養(yǎng)的芽誘導初期，不同取材時間對誘導芽萌發(fā)的效果不同，這種差異可能來自于植物體內(nèi)酚類化合物含量和多酚氧化酶活性的季節(jié)性變化.在芽萌發(fā)初期，葉片及新梢中酚類物質(zhì)較少，隨著新梢的生長，酚類物質(zhì)積累，多酚氧化酶活性增強，取樣外植體容易褐化，會影響初代培養(yǎng)效果.因此，探討出合適的外植體取材時期是誘導藍莓組培快繁成功與否的關鍵因素之一.

涂俊凡等[17]研究了兔眼藍莓外植體取材時間對萌發(fā)誘導效果的影響結果表明，4月下旬到6月上旬為兔眼藍莓莖段最佳取材時期，萌芽率為62.2%.王連潤等[18]在藍莓外植體取材時間對其誘導萌發(fā)率的影響研究中，發(fā)現(xiàn)選取藍莓當年10月生，生長健壯，無病蟲害的枝條以及長有隱芽的莖段材料污染率低.梁曉晶等[19]對取自當年不同時期的藍莓材料做了系統(tǒng)的組培試驗后得出結論，認為4月份是藍莓組培外植體最佳的取材時期，并且還分析了這一結論的原因，主要是由于這段時間的莖段與4月以外的月份相比，分化出的愈傷組織不多，生長速度太快，形成的芽越發(fā)容易分化且同時褐變現(xiàn)象明顯，比其它取材時期獲得的材料減少.

在我國由于四季的更替比較顯著，因此，在氣溫較高、病蟲害比較容易爆發(fā)的6至9月間，用露地栽培的藍莓材料進行組織培養(yǎng)會有污染率較高的缺陷；與此相對地，當年十月到第二年三月之間，盡管由于天氣寒冷，藍莓組培材料的污染率也相對不高，但此時的藍莓長勢也不太好，建立無菌系時無法獲得較高的成苗率.因此，建議選擇4月至6月氣候條件適宜的時期作為外植體取材時間.

2 外植體的滅菌

組織培養(yǎng)環(huán)節(jié)中，滅菌至關重要，直接關系到組培苗誘導的成功率.在進行外植體消毒處理時，所用消毒劑的種類，消毒時間長短等都影響著外植體的污染率.因此，國內(nèi)外學者也做了許多相關研究，取得一定成果.

在植物組織培養(yǎng)技術中，常用的外植體消毒藥劑主要有75%的酒精，0.1%的氯化汞溶液等.而在進行研究試驗或者生產(chǎn)應用當中，選用滅菌劑的種類和滅菌時間的確定等，則一般根據(jù)不同情況及操作者的經(jīng)驗來掌握.通常的消毒程序是先用75%的酒精棉擦拭外植體材料，然后使用消毒藥劑進行滅菌消毒，通常能獲得較好的滅菌消毒效果.然而不同的研究者會使用不同的滅菌劑及不同的外植體和滅菌時間，從而得到不同品種藍莓的最適宜的滅菌條件.常用消毒劑及其消毒效果見表1.

表1 常用消毒劑種類及消毒效果比較[22]

李麗容等[20]研究不同滅菌條件試驗結果表明，藍莓外植體(莖段)較好的滅菌方法為：70%酒精30 s+0.1%升汞6～8 min，其次是70%酒精30 s+2%次氯酸鈉8～10 min.劉明群等[21]認為，對于藍莓外植體的滅菌，推薦采用0.2%升汞滅菌，且滅菌前后均不去葉柄，滅菌時間可依枝條采集時間及老嫩情況而定，一般宜控制在6～8 min.結合現(xiàn)有的研究來看，最有效的藍莓外植體材料滅菌程序一般是——剪取包含有強壯嫩芽的藍莓樹的休眠枝，拿自來水沖洗，這一步的主要目的是要除去藍莓枝表面的異物；然后拿滅菌過的蒸餾水浸泡藍莓枝20～30 min；隨后使用室內(nèi)插瓶水培的方法進行催芽，在長出的芽突破鱗片時，再把枝條剪成2～3 cm的莖段；接著，在超凈工作臺上用75%乙醇溶液進行處理，整個過程花費時間為3～4s，再用無菌水沖洗3～5次，然后用0.1%升汞溶液浸泡外植體約8 min，繼續(xù)用無菌水沖洗1～2次，沖洗時應該要先快后慢；最后，將清洗消毒干凈的新枝條剪成0.5～1.0 cm長的莖段并立即接入誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng).

3 培養(yǎng)基的確定

在國內(nèi)外的藍莓組織培養(yǎng)試驗及實際生產(chǎn)當中，藍莓莖段培養(yǎng)使用得最多的基本培養(yǎng)基大體上是MS、1/2MS、White、WPM、改良WPM、knops培養(yǎng)基和B5等七類.Wolfe利用這七類培養(yǎng)基，通過比較它們的培養(yǎng)效果后發(fā)現(xiàn)，WPM培養(yǎng)基在藍莓組織培養(yǎng)中作為基本培養(yǎng)基的效果是最好的[23].但是一般而言，都不會直接使用這幾種培養(yǎng)基，而是會稍作改良，常常是把WPM培養(yǎng)基中的K2SO4、CaCl2、FeSO4和Na2EDTA等鹽類用Ca(NO3)2·4H2O 684 mg/L、KNO3190 mg/L、C10H13FeN2NaO873.4 mg/L和鹽酸硫胺素0.1 mg/L代替，這樣的培養(yǎng)基被稱為改良型WPM培養(yǎng)基.盡管有這樣的改進，改良型WPM培養(yǎng)基以及基本培養(yǎng)基中的能量物質(zhì)一般只夠維持被培養(yǎng)物的基本生存所需，若是要得到較好的培養(yǎng)效果，必須得在基本培養(yǎng)基里添加相當數(shù)量的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，如此方可誘導細胞的脫分化和再分化，從而最終發(fā)育為健康的試管苗.植物組織培養(yǎng)中用的較普遍的植物激素通常為生長素、細胞分裂素和赤霉素，而這些激素的種類、搭配比例等搭配方案對外植體的誘導效果間的差異是十分明顯的.研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中較高的生長素/細胞分裂素比值適宜用作生根培養(yǎng)；而較低的比值則適用于進行新芽的誘導；而在兩者的比例十分接近的情況下就更容易誘導產(chǎn)生愈傷組織.張力思等[24]進行的不同配比的營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)基對4種藍莓誘導效率的影響得出的結果是，在WPM基本培養(yǎng)基中加入玉米素(Zeatin)會提高增殖效率，加入反玉米素(Trans-Zeatin)則增殖效率適宜，加入反玉米素核苷(Trans-Zeatin Riboside)反而會降低增殖效率.董朝莉[25]試驗發(fā)現(xiàn)，藍莓莖段的離體增殖率會受到細胞分裂素種類、濃度的影響，并且發(fā)現(xiàn)使用ZT1～2 mg/L和2ip10～20 mg/L的效果較好.廉家盛[26]在使用美登藍莓進行不定芽分化培養(yǎng)時，用B5培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，結果發(fā)現(xiàn)，加入2 mg/L ZT時誘導愈傷組織效率最高，進而分化出不定芽.在藍莓外植體增殖培養(yǎng)研究中，添加BA時，外植體也增殖，但其增殖率和成苗率均低于ZT的影響[27].也有研究發(fā)現(xiàn)在組織培養(yǎng)時，需要黑暗條件下培養(yǎng)1～2周，然后才能見光；若預先沒有在黑暗條件下進行培養(yǎng)，那么不管添加哪種細胞分裂素，分化率均比較低[28].

后期的初代培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基，都是以基本培養(yǎng)基為基礎再配合各階段對培養(yǎng)基的不同要求所進行的改良.劉作梅等[29]以一年生“南高叢”藍莓所作的研究表明，叢生芽誘導最適宜培養(yǎng)基為改良WPM+ZT1.0 mg/L，萌動率達95%；叢生芽增殖培養(yǎng)最適宜培養(yǎng)基為改良WPM+KT0.5 mg/L，且增殖系數(shù)為4.1.范淑芳等[30]采用陽光藍藍莓作離體繁殖研究結果表明，陽光藍組培苗的離體繁殖以帶2個芽莖段在WPM+2.0 mg/L ZT+0.01 mg/L IBA中進行增殖培養(yǎng)、在1/2WPM+0.10 mg/L IBA+1 000.0 mg/L AC中進行生根培養(yǎng)效果較佳.

4 存在的問題及解決對策

綜上所述，在藍莓組培無菌系建立的研究中，我國雖然取得了相當大的成就，研究內(nèi)容比較廣泛，但研究的深度以及系統(tǒng)性不夠成熟，存在不少問題.具體表現(xiàn)在以下3個方面：

(1)一方面，在藍莓組培的過程中還存在較高的污染率，且分化率、生根率和移栽后種苗成活率都需要通過改進培養(yǎng)技術來得到進一步提高；另一方面，大規(guī)模藍莓組培過程中使用的大量甚至過量的消毒劑和殺菌劑等藥品，會帶來一系列的環(huán)境污染問題.因此，技術層面的創(chuàng)新，如尋找新的消毒劑殺菌劑等材料或者方法，進一步簡化規(guī)范化組培操作過程中的程序以減少污染率，試驗新的培養(yǎng)基組合以提高組培材料的分化率、生根率以及種苗的存活率等技術，將是日后藍莓組培的重要任務.近幾年已經(jīng)有學者提出采用無糖培養(yǎng)微繁技術和開放式組培法兩種組培技術代替?zhèn)鹘y(tǒng)的組培技術[31]，以解決環(huán)境污染問題和組培種苗效率低下的缺陷.但這兩種方法在具體實施過程中的效果以及可能存在的負面效應仍需積極探索，至少是值得嘗試的新的方法和技術.

(2)國內(nèi)研發(fā)的許多藍莓品種的快繁體系在橫向上沒有系統(tǒng)的比較，還缺乏相同品種藍莓在縱向上的組織培養(yǎng)技術各個環(huán)節(jié)與過程的深入總結歸納和理論構建.不同品種的藍莓在組培的相關環(huán)節(jié)會存在技術規(guī)程的細微差異，這些差異將對組培的效果產(chǎn)生較大的影響.因此，針對某些優(yōu)良品種的藍莓，應當充分試驗出其可靠標準的組培規(guī)程和方法，各個擊破，建立優(yōu)良藍莓品種的系統(tǒng)化組培程序.

(3)盡管我國對已有品種的藍莓組織培養(yǎng)獲得了數(shù)量相當可觀的無性系建立案例，但依靠組織培養(yǎng)技術力量來進行新品種選育的研究還很少見，需要更成熟完善的藍莓組培技術體系或者操作規(guī)程.

因此，在未來的藍莓組培研究中，首先要創(chuàng)建能夠不受時空限制的國內(nèi)主栽藍莓品種離體再生和轉(zhuǎn)化體系，并且用基因技術優(yōu)化品種質(zhì)量提供技術支撐建設完備的大平臺.然后，增加對藍莓組培中植物生理變化過程的深入研究.最后，在理論構建較完備，試驗數(shù)據(jù)足夠豐富的前提下，開展工廠化高效再生體系的研究以及基因轉(zhuǎn)化育種等方面的研究.

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