GPR37調(diào)節(jié)巨噬細胞的吞噬功能并參與炎癥痛的消退

研究背景

炎癥的主要有五大表現(xiàn)：紅、腫、熱、痛和功能喪失。作為炎癥最主要的特征，疼痛通過向大腦發(fā)出警告（傷害性）信號并觸發(fā)逃避反應來保護炎性組織。與此同時，外周神經(jīng)系統(tǒng)中的傷害性感受器也同步激活，通過產(chǎn)生神經(jīng)肽（如P物質(zhì)）和趨化因子（如CCL2）等引起神經(jīng)源性炎癥和神經(jīng)炎癥。組織損傷后的炎癥會導致免疫細胞的募集并且進入受損部位。根據(jù)細胞種類的不同，不同的細胞進入受損組織的速度也不同：中性粒細胞可以在在幾小時內(nèi)進入受損的組織，而巨噬細胞往往需要幾天。這些免疫細胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，如促炎細胞因子 (TNF-α，IL-1β)，通過與皮膚、肌肉和關(guān)節(jié)組織傷害感受器上的細胞因子受體結(jié)合而引起炎癥性疼痛?？煽氐难装Y具有生理性保護功能，適度炎癥是為了消除細胞損傷的最初誘因，促進組織修復進而恢復內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。急性炎癥的消退是一個活躍的過程包括SPMs(specialized proresolving mediators) 的產(chǎn)生。SPM相比較于嗎啡，可以以更低劑量顯著抑制炎性痛。值得一提的是，由DHA合成的PD1 (protectin D1) 和NPD1(neuroprotectin D1) 可以通過對神經(jīng)元、免疫細胞和膠質(zhì)細胞的多重作用，有效抑制炎癥反應和炎性痛。

研究證明SPMs可以通過促進吞噬清除炎癥反應的病原體和細胞碎片以消退炎癥。在哺乳動物免疫系統(tǒng)中，吞噬反應是由免疫細胞與PAMPs (pathogen-associated molecular patterns)的接觸所激活，如酵母聚糖。巨噬細胞在吞噬中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，并且表現(xiàn)出不同的亞型，如促炎的M1型和抑炎的M2型。但是，巨噬細胞吞噬和表型改變的信號通路和分子機制仍未完全闡明。

GPR37是一種parkin蛋白的底物，高表達于腦，并與腦神經(jīng)紊亂性疾病如帕金森病和孤獨癥等密切相關(guān)。GPR37還可與多巴胺轉(zhuǎn)運體結(jié)合參與調(diào)節(jié)多巴胺的攝取。也有研究表明GPR37基因突變與孤獨癥譜系障礙密切相關(guān)。然而，GPR37在免疫細胞的作用仍未闡明。本研究發(fā)現(xiàn)GPR37表達于巨噬細胞而不是小膠質(zhì)細胞，并且證明GPR37是NPD1的潛在受體，在NPD1誘導的巨噬細胞胞內(nèi)鈣離子信號和吞噬中發(fā)揮必不可少的作用。GPR37基因缺失的巨噬細胞中NPD1的功能被取消。因此，本研究得出結(jié)論：GPR37在巨噬細胞介導的炎癥痛的消退中至關(guān)重要。

主要研究結(jié)果

作者首先利用免疫組織化學的方法，檢測了GRP37的組織與細胞分布情況。IHC結(jié)果顯示，GPR37定位于小鼠后足皮膚的真皮層，雙標染色結(jié)果顯示GPR37主要與巨噬細胞標記物CD68共標，而與小膠質(zhì)細胞標記物CX3CR1沒有共標，LacZ染色也沒有發(fā)現(xiàn)表達GPR37的細胞核與IBA-1（小膠質(zhì)細胞標記物）共標。因此GPR37表達于巨噬細胞，而不是小膠質(zhì)細胞。

作者接下來考察了細胞內(nèi)鈣離子濃度的改變是否與GRP37有關(guān)。首先作者構(gòu)建了GPR37的表達載體并且轉(zhuǎn)染到HEK293細胞上，接下來對過表達GPR37的HEK293細胞進行鈣成像，發(fā)現(xiàn)TX14和NPD1均可以顯著增加iCa2+。而在巨噬細胞中NPD1誘導的iCa2+增加在GPR37基因缺失的巨噬細胞中被取消。以上數(shù)據(jù)可以證明NPD1通過GPR37誘導巨噬細胞和HEK293細胞iCa2+增加。

作者接下來考察了GPR37對于巨噬細胞吞噬功能的影響。作者采用了熒光標記的酵母聚糖顆粒吞噬法檢測了巨噬細胞的吞噬活性。結(jié)果顯示NPD1可以劑量依賴性的增加吞噬活性，并且在GPR37基因缺失的巨噬細胞中被取消。進一步研究證明NPD1誘導的吞噬可以被鈣離子螯合劑、PTX、ERK信號通路抑制劑和PI3K/AKT抑制劑所抑制。所以，NPD1可能是通過GPR37，iCa2+，PI3K/AKT和ERK信號通路誘導巨噬細胞的吞噬。

在離體水平的實驗結(jié)果并不一定在整體動物水平中可以被重現(xiàn)出來，因此作者進一步采用了小鼠模型來進一步驗證GPR37對于巨噬細胞吞噬功能以及炎癥消退的結(jié)果。在小鼠后足足底注射熒光標記的酵母聚糖顆粒制備炎癥痛模型，觀察水腫時間，免疫細胞（巨噬細胞和中性粒細胞）的浸潤和巨噬細胞吞噬酵母聚糖的情況。水腫發(fā)生于2 h，4 h達峰，之后稍有降低并持續(xù)1天，第8天完全恢復。IHC結(jié)果顯示免疫細胞的浸潤，最早發(fā)生浸潤的是中性粒細胞，之后是巨噬細胞。雙重免疫染色結(jié)果顯示吞噬的酵母聚糖主要定位于表達GPR37的巨噬細胞，Gpr37-KO小鼠中吞噬的酵母聚糖水平顯著降低。

酵母多糖增加WT小鼠炎性皮膚Il1b mRNA水平和IL-1β蛋白水平，但是在Gpr37-KO小鼠中增加程度更高。同時，酵母多糖可以從mRNA和蛋白水平增加WT小鼠炎性皮膚抗炎因子IL-10和TGF-β水平，但在Gpr37-KO小鼠中作用被取消。GPR37通過抑制酵母多糖激活的巨噬細胞促炎因子(IL-1β)的表達和促進抗炎因子 (IL-10，TGF-β)的表達調(diào)節(jié)巨噬細胞的表型。

通過足底注射聯(lián)合應用WT 巨噬細胞和IL-10的抗體阻斷巨噬細胞的IL-10。發(fā)現(xiàn)WT 巨噬細胞移植到GPR37缺陷小鼠中可促進炎性疼痛的消退。這一結(jié)果表明，WT 巨噬細胞可能通過IL-10分泌參與炎癥痛的消退。

討 論

本研究首次揭示了GPR37表達于巨噬細胞，而不是小膠質(zhì)細胞。GPR37作為NPD1的潛在受體，在NPD1誘導的巨噬細胞吞噬過程中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用。GPR37分子是NPD 1誘導的巨噬細胞內(nèi)Ca2+信號轉(zhuǎn)導和吞噬所必需的。NPD 1的這些作用在GPR 37缺乏的巨噬細胞中被取消。本研究發(fā)現(xiàn)GPR37另一個重要作用是調(diào)節(jié)巨噬細胞表型。表達GPR37的巨噬細胞表現(xiàn)出更多的M2型而不是M1型，產(chǎn)生低水平的IL-1β和高水平的IL-10和TGF-β，進而導致炎癥的消退。因此，藥理學上增強吞噬能力和巨噬細胞表型的轉(zhuǎn)化在治療慢性炎癥性疾病和慢性疼痛上有巨大潛力。

炎癥的主動消退已成為一種新型的炎癥痛治療策略。以往研究的轉(zhuǎn)化落腳點不足。而本研究不僅為炎癥的消退提供了一個在巨噬細胞上而不僅僅是小膠質(zhì)細胞上的靶分子-GPR37，并且還證明GPR37對巨噬細胞介導的炎性疼痛的解決至關(guān)重要；還進一步找到了調(diào)節(jié)GPR37分子的藥物先導化合物，一個來自于魚油的衍生物NPD1。 用NPD1或其他仿制藥或GPR37的小分子激動劑特異性靶向巨噬細胞GPR37，很可能成為治療炎癥痛和其他炎癥相關(guān)疾病的關(guān)鍵手段。

利用巨噬細胞而不是殺傷巨噬細胞來“退炎鎮(zhèn)痛”在未來可能成為新的鎮(zhèn)痛藥物研發(fā)策略。