富血小板纖維蛋白聯(lián)合自體軟骨顆粒修復(fù)兔耳軟骨缺損

王 秀，張正文，謝 鋒

（河南省人民醫(yī)院整形外科 河南 鄭州 450000）

自體軟骨因取材豐富、組織相容性好、易于成活、與機體無排斥反應(yīng)、感染及外露率低等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于整形外科手術(shù)中，然而軟骨移植術(shù)后，供區(qū)若遺留間隙或滲血可能會發(fā)生血腫、繼發(fā)感染、局部皮膚壞死。鼻中隔術(shù)區(qū)可能出現(xiàn)黏骨膜壞死和穿孔，耳廓再造術(shù)中因切取肋軟骨量較大，供區(qū)(尤其是兒童患者)術(shù)后可能會出現(xiàn)一定程度的胸廓畸形，并對正常胸廓形態(tài)發(fā)育產(chǎn)生一定影響。胸部術(shù)區(qū)軟組織量多，一旦發(fā)生感染預(yù)后瘢痕明顯或增生，外形異常甚至牽拉乳房移位變形等一系列并發(fā)癥，致使患者及家屬對手術(shù)效果不滿意。供區(qū)軟骨自身修復(fù)能力較差及創(chuàng)面恢復(fù)過程中的相應(yīng)并發(fā)癥一直是臨床醫(yī)師需要解決的難題。2001年法國科學(xué)家Choukroun[1]提取出第二代血小板濃縮制品富血小板纖維蛋白( platelet -rich fibrin，PRF），取自自體，直接經(jīng)離心所得，未添加任何生物制劑，被證明具有促進軟組織的修復(fù)，減輕炎性反應(yīng)和水腫，誘導(dǎo)干細胞的增殖、分化、運動、凋亡及促進骨組織修復(fù)重建的能力。近年來利用顆粒軟骨單獨或利用其他材料包裹移植進行各種軟骨缺損的修復(fù)手術(shù)及鼻整形中的應(yīng)用取得較好的手術(shù)效果[2-3]，為顆粒軟骨的利用提供了依據(jù)。本基礎(chǔ)實驗觀察PRF結(jié)合顆粒軟骨修復(fù)兔耳軟骨缺損的修復(fù)情況，為臨床軟骨移植術(shù)后供區(qū)修復(fù)提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物：12～16周生長期雄性新西蘭大白兔30只，體重3.2～3.5kg，均購自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗室，清潔級，普通環(huán)境下籠內(nèi)單獨飼養(yǎng)（均遵照河南省人民醫(yī)院實驗動物飼養(yǎng)與使用規(guī)定）。動物購置后適應(yīng)環(huán)境2周。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組：將30只實驗兔，隨機分為5組，空白對照組、顆粒軟骨組、PRF組、PRF+顆粒軟骨組、軟骨塊回置組，每只實驗兔雙耳對稱區(qū)各取一處作為實驗區(qū)，每組12個標(biāo)本。

1.2.2 PRF制?。簩嶒瀯游锓Q重,7%的水合氯醛注射液按3ml/kg從耳緣靜脈麻醉，麻醉成功耳中動脈抽血10ml置于5ml無菌玻璃試管，離心機3 000r/min離心10min，可見血液分為3層，上層清亮液為血清，底層為破碎紅細胞層，中間乳白色為纖維蛋白凝膠層[4]（圖1），取離心后試管中的中間層，保留少量底部紅細胞層，放置于白色無菌紗布上，靜置5min，稱重，制備成100mg凝膠塊（圖2），輕輕按壓擠出剩余水分使之成膜狀備用。

1.2.3 制作軟骨缺損動物模型及顆粒軟骨的制?。河诟鹘M標(biāo)記實驗區(qū)切取面積約1.0cm×0.6cm的全層軟骨組織。并將顆粒軟骨組、PRF+顆粒軟骨組切取的軟骨取0.5cm×0.4cm大小的組織切成直徑約1mm的軟骨顆粒備用。1.2.4 缺損修復(fù)：各術(shù)區(qū)創(chuàng)面嚴(yán)密止血，反復(fù)沖洗后，空白對照組創(chuàng)面不作任何處理；顆粒軟骨組創(chuàng)面置入制取的顆粒軟骨；PRF組創(chuàng)面內(nèi)置入PRF；PRF+顆粒軟骨組將軟骨顆粒+PRF置入缺損部位；軟骨塊回置組將所取軟骨塊原位回置于創(chuàng)面。每組間斷縫合切口，術(shù)區(qū)涂抹紅霉素軟膏后處于暴露狀態(tài)，放回原籠中，自由活動，定期換藥。

圖1 制得的PRF（乳白色凝膠狀物） 圖2 制備的100mg PRF凝膠塊

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 大體觀察：術(shù)后觀察實驗兔活動、進食及切口的感染、血腫等一般情況。切取耳廓組織標(biāo)本后觀察大體形態(tài)及術(shù)區(qū)修復(fù)情況，包括缺損被覆程度、軟骨缺損區(qū)邊界與新生軟骨表面情況等。

1.3.2 組織學(xué)觀察：于術(shù)后4周、8周、12周分別切取各組實驗兔耳軟骨缺損段修復(fù)組織，標(biāo)本置于體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛溶液中固定，脫鈣，梯度乙醇脫水，石蠟包埋后，切片行蘇木精-伊紅（Hematoxylin and Eosin，HE）染色，光鏡下對修復(fù)組織的性質(zhì)進行組織學(xué)觀察了解修復(fù)組織的微觀結(jié)構(gòu)及特點和軟骨細胞存活及再生情況。組織學(xué)觀察指標(biāo)依據(jù)Wakitanni[5]軟骨缺損的組織學(xué)修復(fù)評分量表進行評估，主要包括組織形態(tài)學(xué)、細胞外基質(zhì)、表面平整度、新生軟骨厚度及移植組織與正常軟骨融合度5個指標(biāo)，總分0～14分，分?jǐn)?shù)越低表示修復(fù)效果越好。見表1。

表1 軟骨缺損修復(fù)組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn) （分）

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析：數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。先經(jīng)Levene齊性檢驗各時間組方差均滿足齊性要求（P＞0.05)。組織學(xué)評分結(jié)果行單因方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗， 數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察結(jié)果：所有實驗動物無死亡，均進入結(jié)果分析，術(shù)后當(dāng)日進食量減少，第2天基本恢復(fù)進食。顆粒軟骨組1只兔耳術(shù)后出現(xiàn)感染，經(jīng)換藥后自行愈合。余各組實驗兔切口均無紅腫、滲出，無血腫形成，切口均一期愈合。

2.2 缺損修復(fù)情況：空白對照組：4～8周可以看到纖維組織增生明顯，與周圍組織有粘連；12周時缺損軟骨除局部邊緣外無明顯軟骨再生修復(fù)，創(chuàng)面呈瘢痕樣修復(fù)。顆粒軟骨組：4～8周可見顆粒軟骨組織周圍少量增殖軟骨細胞，修復(fù)有限；12周時可見局部缺損邊緣較前縮小，中央無顆粒區(qū)軟骨缺損仍較明顯，修復(fù)組織處表面凹凸不平。PRF組：4～8周時軟骨缺損區(qū)逐漸縮小變淺；12周時可見軟骨缺損區(qū)為薄薄的半透明新生軟骨組織修復(fù)。PRF+顆粒軟骨組：4～8周時可見缺損區(qū)新生軟骨與置入的顆粒軟骨融合良好，軟骨缺損區(qū)逐漸被覆蓋；12周時軟骨軟骨區(qū)修復(fù)良好，局部可觸及突出感。軟骨塊回置組：4～8周時標(biāo)本觀察可見切取軟骨邊緣；12周時軟骨回置區(qū)修復(fù)良好，表面光滑平整。見圖3。

2.3 HE染色鏡下觀察結(jié)果：空白對照組：鏡下可見大量纖維組織修復(fù)組織，排列分布雜亂無章，除靠近邊緣軟骨膜區(qū)見少量增殖的軟骨細胞外，基本未見軟骨細胞。顆粒軟骨組：可見團塊狀軟骨細胞聚集區(qū)，軟骨塊周圍可見新生的軟骨細胞，細胞團之間則為纖維組織填塞，新生軟骨細胞為纖維軟骨和彈性軟骨混合。PRF組：可見增殖的軟骨細胞，軟骨細胞體積較小。PRF+顆粒軟骨組：可見移植顆粒軟骨細胞團周圍出現(xiàn)大量的新生幼稚軟骨細胞，體積較小，數(shù)量多，細胞之間排列緊密，新生軟骨組織逐漸成熟，細胞體積增大，與周圍的軟骨組織逐漸融合到一起。軟骨塊回置組：軟骨細胞形態(tài)基本與周圍正常軟骨細胞相近，軟骨細胞包被于軟骨囊內(nèi)，軟骨周邊部分為幼稚軟骨細胞，體積較小，呈橢圓形，越向中央，軟骨細胞越趨成熟，體積逐漸增大，變成圓形或橢圓形，軟骨基質(zhì)與膠原纖維交織呈網(wǎng)狀。見圖4。

圖3 各組標(biāo)本大體觀察結(jié)果

圖4 各組標(biāo)本HE染色鏡下觀察結(jié)果（200×）

2.4 組織學(xué)修復(fù)評分結(jié)果：由表2可知，PRF+顆粒軟骨組修復(fù)評分顯著低于空白對照組，差異有顯著性意義（P＜0.01）；顆粒軟骨組、PRF組修復(fù)評分均低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05)；顆粒軟骨組、PRF組組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。4周、8周時軟骨塊回置組組織學(xué)修復(fù)評分低于PRF+顆粒軟骨組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05)，12周時兩組間評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。表明PRF聯(lián)合顆粒軟骨移植修復(fù)軟骨缺損效果顯著優(yōu)于軟骨缺損創(chuàng)面自行愈合，且于12周時修復(fù)的軟骨形態(tài)與軟骨塊回置組修復(fù)效果相近；單獨置入顆粒軟骨或PRF修復(fù)軟骨缺損也較缺損軟骨自行愈合效果好。

表2 各組標(biāo)本組織學(xué)修復(fù)評分比較 （分，xˉ±s）

3 討論

自體軟骨來源于自體，無組織排異反應(yīng)，感染和外露率低被廣泛應(yīng)用于整形外科手術(shù)中。自體肋軟骨是國內(nèi)外耳再造支架的最佳選擇，隨著鼻整形技術(shù)的迅速發(fā)展，肋軟骨亦被廣泛用于鼻背、鼻基底的前頜骨及梨狀孔凹陷充填移植和鼻小柱的支撐移植等；耳廓軟骨可作為外側(cè)腳支撐移植物和覆蓋軟骨或硅膠等假體移植物修復(fù)重建鼻翼及鼻尖部亞單位；鼻中隔軟骨可用于鼻中隔撐開、鼻小柱支撐、鼻背充填、鼻尖移植物和鼻翼緣輪廓線移植等。隨著軟骨移植技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，致使供區(qū)軟骨缺損，且軟骨移植術(shù)后，可能會出現(xiàn)感染、血腫等并發(fā)癥，特別是胸部肋軟骨供區(qū)切取較多量肋軟骨后可能會出現(xiàn)一定程度的胸廓畸形。供區(qū)軟骨自身修復(fù)能力較差及創(chuàng)面恢復(fù)過程中可能的并發(fā)癥，耳廓再造或鼻整形過程中或多或少會出現(xiàn)的軟骨碎屑以及小耳畸形患者殘耳組織的再利用一直是臨床醫(yī)師不斷探索的難題。國外學(xué)者利用耳再造術(shù)后產(chǎn)生的軟骨碎屑回置于肋軟骨供區(qū)，明顯減少了胸廓畸形的發(fā)生率[6-7]，為供區(qū)軟骨缺損修復(fù)提供了參考。

PRF是法國科學(xué)家 Choukroun 于2001年首先報道的，是一種富含纖維蛋白、白細胞和大量生長因子的第二代血小板濃縮物，為三分子立體、疏松網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，其分子結(jié)構(gòu)類似于天然血凝塊。相較于PRP的四分子結(jié)構(gòu)，具有較大的孔隙及良好的彈性，有利于細胞因子的滯納和細胞的長入[5,8]，從而延長生長因子的釋放時間。PRF中血小板活化后可釋放轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、血小板源生長因子(PDGF)、血管內(nèi)皮因子(VEGF)、胰島素樣生長因子(IGF-1)、成纖維細胞生長因子(FGF)和表皮生長因子(EGF)等[9-10]，這些生長因子可促進軟組織的修復(fù)，減輕炎性反應(yīng)和水腫，誘導(dǎo)干細胞的增殖分化、運動、凋亡以及和促進骨愈合及改建[11]。PRF緩慢釋放上述各種生長因子，能夠促進軟骨細胞的增殖和軟骨組織細胞外基質(zhì)的生成，促進骨間質(zhì)干細胞的增殖和分化，提高成骨細胞蛋白激酶和骨保護素的表達，促進成骨細胞的增殖和分化及新骨形成能力[10,12-13]。Bahmanpour[14]等在兔關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)實驗中通過6組對照實驗得出PRF包裹SDF-1（cell-derived factor-1）對軟骨全層缺損的修復(fù)作用依據(jù)國際軟骨修復(fù)協(xié)會評分顯著高于其他各組。張文麗[15]等觀察PRF復(fù)合自體第3代BMSCs修復(fù)牙槽骨缺損的能力,發(fā)現(xiàn)其促進牙槽骨的再生與修復(fù)的能力顯著優(yōu)于其他對照組。楊勇等[16]用兔自體脂肪干細胞(ADSCs)與PRF復(fù)合修復(fù)家兔耳軟骨全層缺損，較單純置入自體未誘導(dǎo)的ADSCs組和單純置入PRF組可以更加有效地修復(fù)兔耳軟骨全層缺損。但是進行干細胞培養(yǎng)和移植要求條件較高，周期長，細胞誘導(dǎo)效果不穩(wěn)定，移植后遠期效果無法預(yù)測等，使其在具體臨床應(yīng)用中的推廣受到限制。

顆粒軟骨，即將自體軟骨剪切成約1.0mm大小的顆粒狀軟骨組織。通常將其直接或利用不同材料包裹進行移植。1983年，Akecht等將兔自體軟骨顆粒聯(lián)合纖維粘合劑修復(fù)軟骨缺損并發(fā)現(xiàn)明顯的新生透明軟骨[17]，之后大量的基礎(chǔ)實驗也得出了相似理論[18-19]。進行顆粒軟骨移植的理論基礎(chǔ)是：將軟骨制備成1～2mm大小的顆粒，可以使軟骨細胞有效地從細胞外基質(zhì)中釋放出來，從而形成新的軟骨樣基質(zhì)[20]。自體顆粒軟骨是一個較理想的移植材料，取自自體，顆粒狀易塑形成各種不同的形狀以適應(yīng)不同的供區(qū)，又增加了對軟骨的利用率。但其術(shù)后遠期有一定的吸收率，顆粒越細越小吸收越多，而且術(shù)后一旦出現(xiàn)感染局部產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)也使軟骨吸收增多。顆粒軟骨易吸收的原因可能有：①脫離軟骨膜的保護，缺乏營養(yǎng)供應(yīng)；②力學(xué)環(huán)境的改變，顆粒軟骨的生長失去一定的應(yīng)力刺激；③自身抗原的暴露，加工顆粒軟骨的過程令平時被軟骨基質(zhì)保護而未被識別的軟骨細胞暴露于自身免疫系統(tǒng)中，加重其炎癥反應(yīng)[21]。為進行顆粒軟骨移植及減少吸收率，前人進行了大量的探究。利用不同包裹材料包括氧化纖維素、自體筋膜組織及生物膠等，術(shù)后均存在一定的軟骨吸收、術(shù)區(qū)臃腫或供區(qū)出現(xiàn)瘢痕等并發(fā)癥，應(yīng)用受到限制[22-23]。Bullocks等[24]采用自體混合凝膠ATG聯(lián)合顆粒軟骨進行鼻背填充，未出現(xiàn)明顯的軟骨吸收及并發(fā)癥。因而利用本身具有抗感染而又具有促進軟骨細胞增殖的材料包裹顆粒軟骨就成了提高軟骨移植成活率及減少遠期吸收率的有效方法之一。

本次利用PRF能夠有效抗炎、促進軟組織修復(fù)及新骨形成結(jié)合顆粒軟骨的軟骨細胞能夠從細胞外基質(zhì)中釋放出來促進新生軟骨生成的原理進行實驗設(shè)計的。依據(jù)大體標(biāo)本及組織學(xué)觀察可見PRF+顆粒軟骨組移植軟骨顆粒成活良好，且軟骨周圍可見大量新生軟骨，新生軟骨組織與原軟骨組織形態(tài)相近，組織融合良好。軟骨缺損修復(fù)較空白對照組缺損軟骨組自行愈合有明顯優(yōu)勢（P＜0.01），12周時修復(fù)的軟骨組織形態(tài)與周圍組織軟骨組織相近。單獨顆粒軟骨或PRF置入對軟骨缺損修復(fù)亦有一定的促進作用。單獨置入顆粒軟骨主要為軟骨缺損邊緣或顆粒軟骨周圍局部組織的修復(fù)，缺損中央?yún)^(qū)或軟骨顆粒缺乏區(qū)修復(fù)有限；單獨置入PRF軟骨缺損處增殖軟骨細胞少且小，為纖維軟骨修復(fù)為主，修復(fù)后軟骨組織較正常軟骨組織薄。本研究顯示：PRF結(jié)合顆粒軟骨對軟骨供區(qū)的軟骨組織缺損有良好的修復(fù)效果，單獨置入PRF或顆粒軟骨亦較軟骨缺損區(qū)自行修復(fù)效果好。在實驗過程中應(yīng)注意PRF制備工作中要求采血迅速，一旦抽血過程延緩，置入玻璃試管中時血液震蕩較多，或是離心不及時等，均會導(dǎo)致制備PRF失敗。有時可能需要多次操作才能制備出合格足量的PRF組織，故在制備PRF時注意采血的迅速，在離心過程中注意配平，離心管在離心過程中盡量避免搖晃引起血液凝固。本實驗亦存在不足及需進一步研究之處：①顆粒軟骨移植有一定的吸收率，本實驗觀察時間較短，實驗標(biāo)本量較小，無法評估遠期移植顆粒軟骨吸收情況及缺損面修復(fù)效果；②PRF完全取自自體，而個體抽取血液有限，限制了大范圍、大面積組織修復(fù)的應(yīng)用；③軟骨顆粒原位移植的存活率較異位存活率是否更高；④對于大面積的軟骨缺損，如耳再造后肋軟骨供區(qū)，是否可以直接利用制得的PRF凝膠結(jié)合軟骨顆粒進行移植以擴大包裹及覆蓋面積修復(fù)缺損有待進一步研究。希望通過進一步的實驗研究，取得更多理論依據(jù)的支持，為臨床的進一步應(yīng)用提供參考。

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