不同冷凍方法對(duì)人睪丸精子冷凍保存效果的研究

王乃輝，柳立軍，薛石龍，侯建文，景原雪，宋德瀟，岳豐，李艷梅，張學(xué)紅

(1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)專(zhuān)科醫(yī)院，蘭州 730000；2.甘肅省生殖醫(yī)學(xué)與胚胎重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000)

無(wú)精子癥在男性不育人群中的發(fā)生率為10%～15%[1]，對(duì)于這部分患者，供精是過(guò)去唯一的治療方案。隨著卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)的誕生，作為男性不育治療的睪丸組織活檢技術(shù)得以發(fā)展[2-3]，包括采用睪丸精子抽吸術(shù)、經(jīng)皮附睪精子抽吸術(shù)、睪丸切開(kāi)活檢取精、顯微睪丸切開(kāi)取精等方式獲得睪丸精子，從而使無(wú)精子癥患者有可能獲得自己的遺傳后代。隨著冷凍技術(shù)的不斷發(fā)展，睪丸精子冷凍逐漸發(fā)展起來(lái)，為梗阻性和非梗阻性無(wú)精子癥患者帶來(lái)了福音[4]。國(guó)內(nèi)外研究者嘗試用多種方法保存睪丸活檢精子或ICSI治療后剩余睪丸精子，但其冷凍復(fù)蘇效果尚不十分理想，且冷凍方法及冷凍保護(hù)劑的使用也一直存在爭(zhēng)議[5]。如何提高睪丸精子冷凍復(fù)蘇率，減少或避免無(wú)精子癥患者行二次睪丸穿刺手術(shù)，成為了眾多研究者的關(guān)注熱點(diǎn)。本研究采用不同冷凍載體和冷凍保護(hù)劑對(duì)人睪丸組織進(jìn)行冷凍保存，力求尋找更佳的冷凍方案，提高凍存睪丸精子的復(fù)蘇率。

資料和方法

一、研究材料

1.睪丸組織來(lái)源：收集2016年2～11月在蘭州大學(xué)第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)專(zhuān)科醫(yī)院行睪丸穿刺的患者(包括門(mén)診-診斷性睪丸穿刺及ICSI周期治療)，經(jīng)知情同意，醫(yī)學(xué)倫理會(huì)批準(zhǔn)同意，將剩余的有精子的睪丸組織納入試驗(yàn)。共獲得46份睪丸組織樣本。

2.主要載體和試劑：1.8 ml冷凍管(Corning，美國(guó))，0.25 ml冷凍麥管(CryoBio System，法國(guó))、超微量冷凍麥管(江蘇泰利達(dá))；甘油(sigma，美國(guó))，F(xiàn)asrun冷凍保護(hù)劑組合(包含冷凍液、解凍液、培養(yǎng)液)(江蘇泰利達(dá))，G-MOPS plus(Vitrolife，瑞典)。

3.主要儀器：IVF工作站(K-systems，丹麥)，倒置顯微鏡(Nikon，日本)

二、研究方法

1.分組：46份睪丸組織樣本，每份樣本平均分成4份，隨機(jī)分為A、B、C、D等4組冷凍。A組：1.8 ml冷凍管+甘油復(fù)合冷凍劑；B組：1.8 ml冷凍管+Fasrun冷凍劑；C組：0.25 ml麥管+Fasrun冷凍劑；D組：超微量冷凍麥管+Fasrun冷凍劑。

2.睪丸組織冷凍評(píng)估：冷凍前后，分別記錄各組前向運(yùn)動(dòng)精子數(shù)目、非前向運(yùn)動(dòng)精子數(shù)目、精子復(fù)蘇率。

3.睪丸組織冷凍與復(fù)蘇：將睪丸組織置于1 ml G-MOPSplus培養(yǎng)液中，機(jī)械切碎，觀(guān)察并記錄睪丸組織內(nèi)每200倍視野活動(dòng)精子數(shù)量及正常形態(tài)精子數(shù)量。將睪丸組織離心，去除上清液后置于 Fasrun 培養(yǎng)液，在32℃、7% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min。1 500 r/min，離心4 min，去上清，取1/4睪丸組織置于含有 G-MOPS plus的1.8 ml冷凍管中，巴氏吸管加2～3滴甘油，每滴加完后需充分搖勻(編為A組)；其余睪丸組織按1﹕3比例加入 Fasrun 冷凍液。睪丸組織盡量混勻，將3/4睪丸組織平分為3份，分別加入到1.8 ml冷凍管、0.25 ml麥管、超微量冷凍麥管(分別編為B、C、D組)。然后將A、B、C、D組均放置于液氮上方5 cm處熏蒸10 min，投入液氮。睪丸組織液氮中凍存1周復(fù)蘇，將A、B、C、D組從液氮中取出，37℃水浴1 min后將睪丸組織轉(zhuǎn)入Fasrun解凍液，10 min后倒置顯微鏡下觀(guān)察并記錄睪丸精子復(fù)蘇情況。所有標(biāo)本的冷凍復(fù)蘇操作均由一人完成。

4.觀(guān)察指標(biāo)：冷凍前各組睪丸組織中活動(dòng)精子(前向運(yùn)動(dòng)精子+非前向運(yùn)動(dòng)精子)數(shù)目/200倍視野；解凍復(fù)蘇后，各組睪丸組織中活動(dòng)精子(前向運(yùn)動(dòng)精子+非前向運(yùn)動(dòng)精子)數(shù)目/(200倍視野)，活動(dòng)精子數(shù)目≥0.25/(200倍視野)的例數(shù)、活動(dòng)精子數(shù)目≥0.1/(200倍視野)的例數(shù)(以此為易行ICSI例數(shù))；睪丸精子形態(tài)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究采用SPSS17.0軟件，計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組睪丸精子冷凍復(fù)蘇前后的精子活力變化及復(fù)蘇率

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，各組睪丸精子冷凍復(fù)蘇后與冷凍前相比，精子活力均顯著降低，其中前向運(yùn)動(dòng)精子降低更為明顯；D組復(fù)蘇率最高，顯著高于A(yíng)、B兩組(P<0.05)，C組顯著高于A(yíng)組(P<0.05)；D組略高于C組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

二、不同冷凍方法對(duì)人睪丸精子的凍存效果影響

冷凍復(fù)蘇后，睪丸精子的活力顯著下降，200倍視野能夠觀(guān)測(cè)到的活動(dòng)精子數(shù)目過(guò)少，因此冷凍前記錄數(shù)據(jù)為活動(dòng)精子數(shù)目≥0.5/(200倍視野)的例數(shù)，冷凍后記錄數(shù)據(jù)為活動(dòng)精子數(shù)目≥0.25/(200倍視野)和≥0.1/(200倍視野)的例數(shù)，并以≥0.1/(200倍視野)例數(shù)為易行ICSI病例例數(shù)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，D組冷凍復(fù)蘇后能夠容易找到正常活動(dòng)精子(易行ICSI)的例數(shù)顯著高于A(yíng)組、B組(P<0.05)，C組顯著高于A(yíng)組(P<0.05)(表2)。

表1 冷凍前后各組間睪丸精子活力及復(fù)蘇率比較[(-±s)，%]

注：各組均為46例；與D組相比，*P<0.05；與C組相比，#P<0.05；睪丸精子在200倍視野觀(guān)察，由于精子數(shù)目稀少，表中精子計(jì)數(shù)均為10個(gè)高倍視野數(shù)據(jù)

表2 不同冷凍方法對(duì)人睪丸精子冷凍保存效果的比較[n(%)]

注：與D組相比，*P<0.05；與C組相比，#P<0.05

討 論

隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的無(wú)精子癥患者前來(lái)就醫(yī)，使得睪丸穿刺活檢取精術(shù)的數(shù)量激增。曾經(jīng)，診斷性睪丸穿刺術(shù)及ICSI后的睪丸組織多被視為醫(yī)療廢物而丟棄，患者若要二次進(jìn)行ICSI周期，還需要再次行睪丸穿刺活檢，極大地增加了患者的痛苦。隨著冷凍技術(shù)的發(fā)展，睪丸組織冷凍保存成為現(xiàn)實(shí)，且有報(bào)道稱(chēng)凍融睪丸組織精子與新鮮睪丸組織精子在ICSI治療時(shí)臨床結(jié)局無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[6]。但目前睪丸組織冷凍復(fù)蘇的總體效果并不理想[7]，經(jīng)常需要患者在取卵當(dāng)天再進(jìn)行睪丸穿刺活檢取精，加重了患者的身心痛苦及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，且反復(fù)的睪丸穿刺手術(shù)增加了日后睪丸功能下降的風(fēng)險(xiǎn)[8]。對(duì)于非梗阻性無(wú)精癥者，即使前次手術(shù)取精成功，再次手術(shù)也有15%～20%的失敗風(fēng)險(xiǎn)[9]。睪丸活檢時(shí)凍存精子，以便用于后期ICSI治療，既可以避免反復(fù)睪丸穿刺手術(shù)給患者帶來(lái)的精神、肉體、經(jīng)濟(jì)方面的負(fù)擔(dān)，又能避免取卵日取精失敗從而導(dǎo)致無(wú)法正常受精，方便醫(yī)患雙方掌握治療進(jìn)度。因此，尋求一種更優(yōu)的睪丸組織冷凍保存方案，提高睪丸精子復(fù)蘇率成為我們醫(yī)務(wù)工作者的一項(xiàng)嚴(yán)峻任務(wù)。

冷凍保護(hù)劑在睪丸精子冷凍復(fù)蘇過(guò)程中起著重要作用。睪丸精子冷凍中所用冷凍保護(hù)劑可分為滲透性保護(hù)劑和非滲透性保護(hù)劑，其中常用滲透性保護(hù)劑有：1，2-丙二醇、乙二醇、甘油和二甲基亞砜(DMSO)。1，2-丙二醇滲透性強(qiáng)且毒性較DMSO低；乙二醇可快速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)置換細(xì)胞內(nèi)水分而減少滲透應(yīng)激；甘油及卵黃廣泛應(yīng)用于精液和睪丸細(xì)胞懸液冷凍，對(duì)精子有很好的保護(hù)作用；DMSO分子量小，有較強(qiáng)組織穿透性，對(duì)睪丸組織等固體組織及細(xì)胞懸液能起到較好的保護(hù)作用，是目前睪丸組織冷凍最常用的冷凍保護(hù)劑[5]。非滲透性保護(hù)劑中最常用的是蔗糖，其保護(hù)機(jī)制目前還不明確。本實(shí)驗(yàn)中，冷凍前和解凍后，睪丸精子都要置于Fasrun冷凍保護(hù)劑組合的培養(yǎng)液中培養(yǎng)30 min，孵育睪丸精子，可以明顯提高睪丸精子的活力，以便更快速的篩選出可以用于ICSI的精子。此外，與甘油相比，F(xiàn)asrun冷凍保護(hù)劑中含有的DMSO具有低分子量，高滲透的特性[10]，保證在冰晶形成的過(guò)程中，冷凍保護(hù)劑濃度增加時(shí)仍然能留在溶液中不被析出，從而減少冰晶形成對(duì)精子的損傷。在本實(shí)驗(yàn)中，1.8 ml冷凍管+Fasrun冷凍劑組(B組)和1.8 ml冷凍管+甘油復(fù)合冷凍劑組(A組)比較，睪丸精子的復(fù)蘇率沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，但前者有優(yōu)于后者的趨勢(shì)。

睪丸精子冷凍另一個(gè)重要影響因素：選擇合適的載體[11]。與常規(guī)射出精液相比，睪丸組織中精子很少，且還有曲細(xì)精管等睪丸組織，應(yīng)用常規(guī)冷凍管回收率低。常用的睪丸組織冷凍載體有冷凍管、超細(xì)冷凍管和玻璃化冷凍載體，但對(duì)睪丸精子的保存效果還沒(méi)有定論[12]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用超微量冷凍麥管(D組)，其體積小，降溫速率快，改善了凍融后精子活力，因此睪丸精子復(fù)蘇率明顯高于采用了1.8 ml冷凍管的兩組(A、B組)。由于載體體積過(guò)小，將睪丸組織放入載體所需時(shí)間長(zhǎng)，所需載體數(shù)量多，增加了冷凍成本，所以超微量冷凍麥管更適用于極少量精子的冷凍。而對(duì)于1.8 ml冷凍管，其體積相對(duì)較大，所能冷凍的睪丸組織體積大，但由于所需冷凍液多，冷凍過(guò)程中冰晶的形成明顯增加睪丸精子的損傷，不適合用于睪丸精子的冷凍。同樣，精子冷凍復(fù)蘇后的存活率主要取決于細(xì)胞內(nèi)冰晶形成量，體積小、裝載冷凍保護(hù)劑少的載體，能夠增加升溫速率，使溫度能夠快速越過(guò)冰晶形成的溫度，從而減少冰晶形成，降低復(fù)溫對(duì)睪丸精子的損傷。另外，本實(shí)驗(yàn)采用的液氮熏蒸法，在距離液氮相等的高度(5～10 cm)和相同的時(shí)間內(nèi)，液氮吸收的熱量是相同的，載體體積越小，樣本的降溫速率越快。睪丸組織快速越過(guò)冰晶形成的溫度區(qū)，減少了對(duì)精子的損傷。因此隨著載體體積的減小，睪丸精子的復(fù)蘇率逐漸升高。

冰晶的形成與冷凍速率有密切關(guān)系，而冷凍速率由冷凍保護(hù)劑和載體決定[13]。通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)睦鋬霰Ｗo(hù)劑和冷凍載體可減少細(xì)胞內(nèi)冰晶形成，從而提高精子的存活率。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，0.25 ml麥管+Fasrun冷凍保護(hù)劑組(C組)，可以得到和超微量冷凍麥管+Fasrun冷凍保護(hù)劑組(D組)相近的睪丸精子復(fù)蘇率(78.26% vs.86.96%)，但冷凍成本較低且操作過(guò)程也較精簡(jiǎn)，提高了成本效益[14]。由于冷凍睪丸精子與液氮隔絕，避免了污染的可能，生物安全性高[15]。本實(shí)驗(yàn)由于尚處于實(shí)驗(yàn)階段，數(shù)據(jù)量還不夠大，且后期ICSI術(shù)后的受精率、種植率、妊娠率、流產(chǎn)率等數(shù)據(jù)還有待完善。

綜上所述，應(yīng)用改良的超微量冷凍麥管+Fasrun冷凍保護(hù)劑可以提高睪丸組織精子冷凍復(fù)蘇率，是一種比較理想的冷凍方案；0.25 ml麥管+Fasrun冷凍保護(hù)劑的冷凍復(fù)蘇效果稍低于超微量冷凍麥管+Fasrun冷凍保護(hù)劑組，但其冷凍成本方面優(yōu)勢(shì)明顯，也可作為一種備選方案。

[1] Verheyen G，Popovic-Todorovic B，Tournaye H. Processing and selection of surgically-retrieved sperm for ICSI：a review[J]. Basic Clin Androl，2017，27：6. doi：10.1186/s12610-017-0050-2. eCollection 2017.

[2] Craft I，Bennett V，Nicholson N. Fertilising ability of testicular spermatozoa[J].Lancet，1993，342：864.

[3] Palermo G，Joris H，Devroey P，et al. Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte[J]. Lancet，1992，340：17-18.

[4] Picton HM，Wyns C，Anderson RA，et al.A European perspective on testicular tissue cryopreservation for fertility preservation in prepubertal and adolescent boys[J]. Hum Reprod，2015，30：2463-2475.

[5] Onofre J，Baert Y，F(xiàn)aes K，et al. Cryopreservation of testicular tissue or testicular cell suspensions：a pivotal step in fertility preservation[J]. Hum Reprod Update，2016，22：744-761.

[6] 史海躍，陳慧，王華，等. 睪丸精子冷凍復(fù)蘇對(duì)ICSI 助孕結(jié)局的影響[J]. 生殖醫(yī)學(xué)雜志，2016，25：731-733.

[7] Gangraed BK. Cryopreservation of testicular and epididymal sperm：techniques and clinical outcomes of assisted conception[J]. Clinics(Sao Paulo)，2013，68：131-140.

[8] Cohen J，Garrisi GJ，Congedo-Ferrara TA，et al. Cryopreservation of single human spermatozoa[J]. Hum Reprod，1997，12：994-1001.

[9] Verheyen G，Vernaeve V，Van Landuyt L，et al. Should diagnostic testicular sperm retrieval followed by cryopreservation for later ICSI be the procedure of choice for all patients with non-obstructive azoospermia? [J]. Hum Reprod，2004，19：2822-2830.

[10] Yildiz C，Mullen B，Jarvi K，et al. Effect of different cryoprotectant agents on spermatogenesis efficiency in cryopreserved and grafted neonatal mouse testicular tissue[J]. Cryobiology，2013，67：70-75.

[11] Liu F，Zou SS，Zhu Y，et al. A novel micro-straw for cryopreservation of small number of human spermatozoon[J]. Asian J Androl，2017，19：326-329.

[12] Baert Y，Van Saen D，Haentjens P，et al. What is the best cryopreservation protocol for human testicular tissue banking?[J]. Hum Reprod，2013，28：1816-1826.

[13] Liebermann J，Nawroth F，Isachenko V，et al. Potential importance of vitrification in reproductive medicine[J]. Biol Reprod，2002，67：1671-1680.

[14] Schiewe MC，Rothman C，Spitz A，et al. Validation-verification of a highly effective，practical human testicular tissue in vitro culture-cryopreservation procedure aimed to optimize pre-freeze and post-thaw motility[J]. J Assist Reprod Genet，2016，33：519-528.

[15] Yavin S，Aroyo A，Roth Z，et al. Embryo cryopreservation in the presence of low concentration of vitrification solution with sealed pulled straws in liquid nitrogen slush [J]. Hum Reprod，2009，24：797-804.