卵巢儲備功能減退患者新鮮移植周期結局分析

朱靜，周怡然，陳蓓麗，曹云霞

(安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，合肥 230022)

卵巢儲備功能減退(DOR)主要表現(xiàn)為卵巢皮質(zhì)內(nèi)原始卵泡數(shù)量過早耗竭，卵母細胞質(zhì)量進行性下降，導致激素分泌異常及生育力下降[1]。卵巢儲備功能減退的不孕患者約占所有IVF-ET周期的10%左右。這類患者在輔助生殖過程中，常常由于自身卵子數(shù)量及質(zhì)量下降而不能獲得理想的臨床妊娠結局。盡管近些年臨床促排卵方案和實驗室卵子優(yōu)化技術日趨成熟，但DOR患者仍然是臨床醫(yī)生面臨的巨大挑戰(zhàn)。如何為這類患者選擇合適的個體化治療方案達到臨床妊娠的目的值得深入分析和探討。本研究以新鮮移植周期的卵巢儲備功能減退患者為對象，就常見的兩種促排卵方案、年齡、移植胚胎類型三個方面進行分析，為改善DOR患者臨床妊娠結局提供依據(jù)。

材料與方法

一、研究對象及分組

收集2013年6月至2016年6月在本院生殖醫(yī)學中心接受常規(guī)體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子注射(IVF/ICSI-ET)助孕的DOR患者資料。

DOR診斷標準[2]：①月經(jīng)第3 天基礎血清FSH：10～40 U/L或FSH/LH>3.6；②AMH≤2 ng/ml；③自然周期卵泡早期陰道B超提示雙側卵巢竇卵泡數(shù)≤6 個。滿足以上三項中兩項即診斷為DOR。

納入標準：①根據(jù)診斷標準診斷為DOR的患者；②使用長方案或者短方案進行促排卵；③新鮮移植周期。

排除標準：①供卵周期；②夫妻雙方存在染色體異常者；③嚴重影響胚胎著床的因素如全身性疾病(甲狀腺功能異常)、其他生殖系統(tǒng)疾病(宮腔粘連、子宮肌瘤肌瘤直徑>4 cm 和/或子宮內(nèi)膜受壓者)、子宮畸形(雙子宮、單角子宮、子宮縱膈等)。

共收集符合標準的病例251例。根據(jù)年齡與使用促排卵方案的不同，分為4組：年齡<35歲使用長方案組105例，短方案組53例；年齡≥35歲以上使用長方案組37例，短方案組56例。

二、促排卵方案

控制性促排卵按照本中心常規(guī)促排卵方案進行。

1.長方案：于治療前一周期黃體中期(月經(jīng)第18～22 天)根據(jù)患者體重指數(shù)單次注射長效達菲林(3.75 mg/支，益普生，法國)，降調(diào)節(jié)兩周后，行陰道B超監(jiān)測雙側竇卵泡數(shù)，到達降調(diào)節(jié)標準后(FSH≤5 U/L、LH≤5 U/L、E2≤ 183.5 pmol/L)開始啟動促排卵。治療周期第3～5 天給予促性腺激素(rFSH，默克雪蘭諾，德國；HMG，輝凌，瑞士或麗珠制藥)，根據(jù)陰道B超、卵巢反應調(diào)整用藥劑量。

2.短方案：患者于月經(jīng)周期第1～3 日開始注射短效達必佳(輝凌，瑞士)0.1 mg/d，至HCG注射日，月經(jīng)周期第 3～5 日肌注促性腺激素(Gn)促排卵，具體促排卵藥物同長方案。

3.取卵：促排卵過程中通過陰道B超監(jiān)測卵泡直徑，當至少有1個優(yōu)勢卵泡直徑≥18 mm或超過2個卵泡直徑≥17 mm時，停用Gn，于當晚注射HCG(麗珠制藥)5 000 U或艾澤(默克雪蘭諾，德國)250 mg，36～38 h后在陰道超聲介導下行穿刺取卵術。

三、胚胎評分標準

根據(jù)本中心操作流程常規(guī)進行IVF/ICSI受精。卵裂期胚胎(D3胚胎)評分主要依據(jù)胚胎卵裂后細胞數(shù)、細胞形態(tài)及碎片情況進行，囊胚期胚胎評分主要參照Gardner囊胚分級法[3]。選擇卵裂期或者囊胚期優(yōu)質(zhì)胚胎進行移植。

優(yōu)質(zhì)胚胎定義：D3胚胎形成6～8細胞并且碎片<20%細胞體積；D5囊胚為D5≥3BB。

四、新鮮胚胎移植及妊娠判斷

新鮮胚胎移植條件：移植日內(nèi)膜形態(tài)均勻，厚度為8～14 mm；宮腔情況正常，無宮腔積液；取卵數(shù)<20枚，無卵巢過度刺激征(OHSS)或發(fā)生OHSS的傾向；血清孕酮及糖類抗原CA125水平正常。滿足以上四個條件者，選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進行新鮮移植(移植數(shù)≤2 個)，剩余胚胎給予玻璃化冷凍保存于-196℃液氮中。

新鮮周期移植者，取卵日開始口服地屈孕酮片(雅培，荷蘭)或者注射黃體酮(浙江仙琚)進行黃體支持。移植后第14天測血-HCG，陽性者繼續(xù)黃體支持，于移植后第35天行陰道B超檢查，宮內(nèi)見孕囊及原始心管搏動者確診為臨床妊娠。

流產(chǎn)定義：妊娠<28 周、胎兒體重<1 000 g而終止妊娠者，包括早、晚期流產(chǎn)。

五、觀察指標

收集患者一般臨床資料，如年齡、不孕年限、體重指數(shù)(BMI)、基礎FSH值、Gn總量、Gn天數(shù)、內(nèi)膜情況等；比較各組間獲卵數(shù)、受精數(shù)、雙原核受精數(shù)(2PN數(shù))、卵裂數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、移植胚胎數(shù)、冷凍胚胎數(shù)、2PN率(2PN數(shù)/獲卵總數(shù)×100%)、胚胎種植率(孕囊數(shù)/移植胚胎總數(shù)×100%)、臨床妊娠率(臨床妊娠數(shù)/移植周期數(shù)×100%)、流產(chǎn)率(流產(chǎn)數(shù)/臨床妊娠數(shù)×100%)。

六、統(tǒng)計學分析

結 果

一、患者一般資料

共收集病例251例，根據(jù)促排卵方案和患者年齡分為4 組。四組患者的一般臨床資料，包括不孕年限、BMI、基礎FSH值均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；長方案組年齡<35歲患者的竇卵泡數(shù)顯著高于短方案年齡<35歲者(P<0.05)(表1)。

表1 不同促排卵方案/年齡組一般資料(-±s)

注：與同方案≥35歲組比較，*P<0.05；與短方案同年齡組，#P<0.05

二、同一年齡段中不同促排卵方案組的比較

同一年齡段中不同促排卵方案的促排情況比較：年齡<35歲組：長方案與短方案比較，Gn總量、Gn天數(shù)、內(nèi)膜厚度、獲卵數(shù)、受精數(shù)、卵裂數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、冷凍胚胎數(shù)均較高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；年齡≥35歲組：長方案組Gn總量、Gn天數(shù)、受精數(shù)顯著高于短方案組(P<0.05)(表2)。

同一年齡組內(nèi)不同促排卵方案的臨床妊娠結局比較：胚胎種植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，但長方案組在胚胎種植率、臨床妊娠率方面均高于短方案組，且流產(chǎn)率均低于短方案組(P>0.05)(表3)。

表2 不同促排卵方案/年齡組臨床促排卵情況(-±s)

注：與短方案同年齡組比較，*P<0.05；與同方案組≥35歲者比較，#P<0.05

表3 不同促排卵方案/年齡組妊娠結局(%)

三、相同促排卵方案不同年齡組的比較

長方案：年齡<35歲組與年齡≥35歲組比較，Gn使用總量顯著減少(P<0.05)，獲卵數(shù)、受精數(shù)、2PN數(shù)、卵裂數(shù)、冷凍胚胎數(shù)均較高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；短方案：兩個年齡組各臨床指標均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表2、表3)。

四、移植不同發(fā)育階段胚胎妊娠結局比較

251例DOR患者行新鮮周期移植，其中移植D3卵裂期胚胎118例，D5囊胚期胚胎133例，卵裂期胚胎在移植胚胎數(shù)、胚胎種植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率等方面均略高于囊胚期胚胎，但均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表4)。

表4 移植不同發(fā)育階段胚胎妊娠結局比較[(-±s)，%]

討 論

隨著輔助生殖技術的發(fā)展，胚胎體外培養(yǎng)系統(tǒng)的完善，IVF-ET妊娠率不斷提高，給眾多不孕患者帶來了福音。但在利用輔助生殖技術助孕過程中，以卵巢低反應、高周期取消率、低臨床妊娠率為特點[4]的DOR患者給眾多的臨床醫(yī)療工作者帶來了巨大的挑戰(zhàn)。

2009年Kyrou等[5]通過Meta分析認為，在IVF治療過程中，如何提高卵巢儲備功能減退患者的妊娠結局是一個難題，大部分的促排卵方案結局都差強人意。臨床工作中常應用于DOR患者促排卵的方案大致有長方案、短方案、拮抗劑方案及微刺激方案等4種，本中心多采用經(jīng)典的長方案和短方案。Siristatidis等[6]認為在輔助生殖促排卵過程中，長方案是標準的治療方案，但具體哪一種方案應用于DOR患者能獲得理想的結局，仍存在爭議。2014年Revelli等[7]通過一項大型的隨機分組實驗表明，長方案較溫和方案(短方案、拮抗劑、微刺激)能夠增加獲卵數(shù)及胚胎數(shù)目，降低周期取消率，但胚胎種植率、妊娠率無統(tǒng)計學差異。Shanbhag等[8]也認為卵巢儲備功能減退患者中，長方案是最普遍、最經(jīng)典方案。本研究結果與上述學者相似，無論是在年齡<35歲組或者年齡≥35歲組，長方案較短方案能獲得更多的卵母細胞、優(yōu)質(zhì)胚胎及冷凍胚胎。推測長方案主要通過有效的垂體降調(diào)節(jié)作用，使卵泡發(fā)育完全受外源性激素的影響，有效控制內(nèi)源性黃體生成素(LH)，迅速抑制自發(fā)性LH峰，使卵泡募集及發(fā)育趨于同步化，最終導致獲卵數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、冷凍胚胎數(shù)增加；但另一方面，本研究中長方案組患者的基礎竇卵泡數(shù)高于短方案組，提示卵巢的基礎儲備能力不同，這也是影響促排情況的重要因素。

另有多個研究結果顯示，針對DOR患者，增加外源性的Gn用量并不能增加獲卵數(shù)及可利用胚胎數(shù)，不能改善IVF的治療結局[9-10]，相反還明顯增加了患者的經(jīng)濟負擔。亦有報道認為短方案在減少Gn用量和使用時間的同時，能保證DOR患者的治療效果，建議采用短方案促排卵[11]。本研究結果中，長方案相較于短方案，Gn使用總量及時間增加，可能在一定程度上加重了患者的經(jīng)濟負擔，但長方案組獲卵數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)及冷凍胚胎數(shù)明顯增加，促排卵結局明顯優(yōu)于短方案，胚胎種植率、臨床妊娠率亦有增加的趨勢。

大量研究表明，在卵巢低反應人群中，應用長方案可獲得較好的促排卵結局，但臨床妊娠結局未見明顯差異[12-14]。本研究對251例DOR患者新鮮移植周期長方案與短方案進行比較，結果與文獻報道一致，在年齡大于35歲組，長方案能夠使DOR患者獲得更多的卵母細胞，從而得到更多的優(yōu)質(zhì)胚胎。同時在年齡大于35歲組，長方案HCG日內(nèi)膜較短方案厚，且胚胎種植率、臨床妊娠率均較高，流產(chǎn)率較低。推測可能由于長時間的降調(diào)節(jié)不僅對卵巢產(chǎn)生了影響，同時對不規(guī)則增生的子宮內(nèi)膜也起到了一定的抑制作用，Gn啟動后有利于內(nèi)膜同步發(fā)育，患者體內(nèi)激素水平穩(wěn)定，進一步利于內(nèi)膜的穩(wěn)定增長，提高胚胎的種植率及妊娠率。另外，長方案通過降調(diào)節(jié)降低盆腔中具有胚胎毒性的炎性因子濃度，改善盆腔微環(huán)境，可提高臨床妊娠率。盡管本研究中兩種促排卵方案的臨床妊娠結局無統(tǒng)計學差異，但長方案有更明顯的改善趨勢，因此推薦臨床醫(yī)生在評估DOR患者的卵巢儲備情況后可考慮選擇長方案進行促排，為患者爭取更多的獲卵，更多的機會。

眾所周知，年齡是影響卵母細胞質(zhì)量、臨床妊娠結局的重要因素。在影響卵巢儲備的所有因素中，年齡是首要因素，也是卵巢反應性的獨立預測因子[15]。女性在35歲之后卵泡耗竭加速且卵母細胞質(zhì)量下降明顯。當女性年齡大于35歲后，其卵細胞的染色體非整倍體率明顯上升，胚胎出現(xiàn)非整倍體的可能性增高，優(yōu)質(zhì)胚胎減少[16]。Kato等[17]回顧性分析單胚胎移植的6 046個周期，發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增加，臨床妊娠率、分娩率不斷降低。龐麗娥等[18]對年齡35歲以上的DOR患者妊娠率與年齡的關系進行探究也得到相同的結論。本研究顯示在DOR人群中，使用同種促排卵方案的情況下，隨著年齡增加，不孕患者的獲卵數(shù)、受精數(shù)、卵裂數(shù)、冷凍胚胎數(shù)均下降，促排卵結局差，從而導致胚胎種植率、臨床妊娠率的降低，流產(chǎn)率增加，最終導致妊娠結局的下降。

臨床現(xiàn)用于檢測卵巢儲備功能的指標有很多，如基礎FSH、AMH、竇卵泡數(shù)等，但年齡始終是一個重要的生理因素。隨著年齡的增加生理性卵泡池的不斷耗竭及卵母細胞質(zhì)量的下降均可導致臨床妊娠的失敗。因此，對于卵巢儲備功能減退患者，應建議患者早發(fā)現(xiàn)早就診，爭取時機，抓緊治療，以根本上改善臨床妊娠結局。

近年來囊胚培養(yǎng)技術在臨床得到廣泛的開展，囊胚培養(yǎng)系統(tǒng)可以通過進一步體外培養(yǎng)，篩選掉發(fā)育潛能低下的胚胎從而得到優(yōu)質(zhì)的囊胚，但胚胎體外培養(yǎng)至囊胚階段所需培養(yǎng)條件較高，有未形成囊胚取消周期的風險。有學者認為囊胚期胚胎移植能夠提高種植率、臨床妊娠率及活產(chǎn)率[19]。本研究納入的對象均進行新鮮周期移植，通過對DOR患者移植不同發(fā)育階段的胚胎進行比較發(fā)現(xiàn)，移植新鮮周期移植D3卵裂期胚胎與D5囊胚期胚胎，胚胎種植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率均未見明顯差異。DOR患者在行輔助生殖技術助孕過程中，不能得到良好的妊娠結局，主要是卵巢的儲備功能減退，卵母細胞質(zhì)量及數(shù)量發(fā)生明顯下降，通過促排卵方法可能依舊不能得到足夠數(shù)量的優(yōu)質(zhì)卵母細胞，因此每個胚胎對于患者都是彌足珍貴的。2013年美國生殖醫(yī)學協(xié)會(ASRM)認為對IVF結局“預后不良”的患者(高齡、卵巢儲備低下、獲卵數(shù)少)，囊胚移植并不能增加活產(chǎn)率，不建議行囊胚移植。因此對于獲卵較少的DOR患者，可以根據(jù)患者的具體情況進行選擇性囊胚培養(yǎng)，即在第3天進行卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎移植，剩余胚胎進行囊胚培養(yǎng)，這樣可以避免囊胚培養(yǎng)失敗的風險，減少患者助孕次數(shù)。對于獲卵較少的患者建議移植卵裂期的優(yōu)質(zhì)胚胎，增加妊娠機會。

綜上所述，本研究進一步證實臨床經(jīng)典的長方案能夠改善IVF的促排卵結局，增加患者的獲卵數(shù)，提高優(yōu)質(zhì)胚胎率，是一種可行的治療方案；卵巢儲備功能減退患者應盡早就診，盡早治療，爭取時機，以利用輔助生殖技術助孕得到更好的妊娠結局；在獲卵少的情況下建議進行卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎移植、選擇性囊胚培養(yǎng)。在IVF過程中卵巢儲備功能減退患者周期結局影響因素的探索仍需要大量的數(shù)據(jù)進行綜合分析，相關的IVF臨床和實驗室方案需更加關注。

[1] Cohen J，Chabbert-Buffet N，Darai E. Diminished ovarian reserve，premature ovarian failure，poor ovarian responder-a plea for universal definitions[J]. J Assist Reprod Genet，2015，32：1709-1712.

[2] Jahromi BN，Sadeghi S，Alipour S，et al. Effect of melatonin on the outcome of assisted reproductive technique cycles in women with diminished ovarian reserve：a double-blinded randomized clinical trial[J]. Iran J Med Sci，2017，42：73-78.

[3] Gardner DK，Lane M，Stevens J，et al. Blastocyst score affect implantation and pregnancy outcome：towards a single blastocyst transfer[J]. Fertil Steril，2000，73：1155-1158.

[4] Yun BH，Kim G，Park SH，et al. In vitro fertilization outcome in women with diminished ovarian reserver[J]. Obstet Gynecol Sci， 2017，60：46-52.

[5] Kyrou D，Kolibianakis EM，Venetis CA，et al. How to improve the probability of pregnancy in poor responders undergoing in vitro fertilization：a systematic review and meta-analysis[J]. Fertil Steril，2009，91：749-766.

[6] Siristatidis CS，Gibreel A，Basios G，et al. Gonadotrophin-releasing hormone agonist protocols for pituitary suppression in assisted reproduction[DB/OL]. Cochrane Database Syst Rev，2015，(11)：CD006919.

[7] Revelli A，Chiado A，Dalmasso P，et al. “Mild” vs. “l(fā)ong” protocol for controlled ovarian hyperstimulation in patients with expected poor ovarian responsiveness undergoing in vitro fertilization(IVF)：a large prospective randomized trial[J]. J Assist Reprod Genet，2014，31：809-815.

[8] Shanbhag S，Aucott L，Bhattacharya S，et al. Interventions for “poor responders” to controlled ovarian hyperstimulation(COH)in in vitro fertilization(IVF)[DB/OL]. Cochrane Database Syst Rev，2007，(24)：CD004379.

[9] Pal L，Jindal S，Witt BR，et al. Less is more：increased gonadotropin use for ovarian stimulation adversely influences clinical pregnancy and live birth after in vitro fertilization[J]. Fertil Steril，2008，89：1694-1701.

[10] Lekamge DN，Lane M，Gilchrist RB，et al. Increased gonadotropin stimulation does not improve IVF outcomes in patients with predicted poor ovarian reserve[J]. J Assist Reprod Genet，2008，25：515-521.

[11] 唐靜. 不同促排卵方法對卵巢儲備功能下降患者的療效[J]. 實用臨床醫(yī)藥雜志，2016，20：96-99.

[12] Madani T，Ashrafi M，Yeganeh LM. Comparison of different stimulation protocols efficacy in poor responders undergoing IVF：a retrospective study[J]. Gynecol Endocrinol，2012，28：102-105.

[13] 李元，龔斐. 改良超長方案在卵巢低反應患者促排卵治療中的應用[J]. 生殖醫(yī)學雜志，2016，25：681-685.

[14] Dakhly DM，Bayoumi YA，Gad Allah SH. Which is the best IVF/ICSI protocol to be used in poor responders receiving growth hormone as an adjuvant treatment? A prospective randomized trial[J]. Gynecol Endocrinol，2016，32：116-119.

[15] 劉珊，師娟子. 婦女年齡和卵巢儲備與反應的關系[J]. 生殖醫(yī)學雜志，2016，25，879-883.

[16] Marquard K，Westphal L，Milki A，et al. Etiology of recurrent pregnancy loss in women over the age of 35 years[J]. Fertil Steril，2010，94：1473-1477.

[17] Kato K，Ueno S，Yabuuchi A，et al. Women’s age and embryo developmental speed accurately predict clinical pregnancy after single vitrified-warmed blastocyst transfer[J/OL]. Reprod Biomed Online，2014，29：411-416.

[18] 龐麗娥，喬宗惠，吳麗敏，等. 不同年齡卵巢儲備功能下降患者體外受精胚胎移植臨床結局比較[J]. 生殖與避孕，2016，36：945-949.

[19] 劉玲，許蓬，楊逸塵，等. 卵裂期與囊胚期胚胎移植妊娠安全性和出生性別比的比較[J]. 生殖醫(yī)學雜志，2017，26：640-645.