新型超臨界流體色譜儀在磺胺藥物分析中的應(yīng)用研究

陳海 李勝迎 劉大偉 張大兵 尤慧艷,2

(1. 江蘇漢邦科技有限公司研發(fā)部， 江蘇 淮安 223005; 2. 大連大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院， 遼寧 大連 116622)

新型超臨界流體色譜儀在磺胺藥物分析中的應(yīng)用研究

陳海1李勝迎1劉大偉1張大兵1尤慧艷1,2

(1. 江蘇漢邦科技有限公司研發(fā)部， 江蘇 淮安 223005; 2. 大連大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院， 遼寧 大連 116622)

采用新型超臨界流體色譜儀，在優(yōu)化條件下于7 min內(nèi)完成對(duì)4種磺胺類藥物的分離。考察了色譜填料類型、共溶劑類型、共溶劑比例、背壓、流速、柱室溫度等條件對(duì)樣品保留行為的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，色譜填料類型對(duì)樣品保留行為的影響最為明顯，正相硅膠柱最適合分離該類藥物；共溶劑種類、共溶劑比例及流速對(duì)保留行為產(chǎn)生影響，其中甲醇最適用于該樣品的分離，共溶劑比例越高、流速越快，洗脫時(shí)間也越短；背壓和柱室溫度的改變對(duì)該樣品的保留行為影響較小。

超臨界流體色譜； 磺胺類藥物； 優(yōu)化； 保留行為

磺胺類藥物是一組具有氨基磺酰胺磺胺結(jié)構(gòu)的合成藥物，其作用是預(yù)防和治療全身細(xì)菌感染[1-3]，具有抗菌譜廣、療效強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、產(chǎn)能高、價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn)?；前奉愃幬飸?yīng)用廣泛，其不足之處是，只要攝入就會(huì)在人體內(nèi)積累下來，使得體內(nèi)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。此外，磺胺類藥物還有可能導(dǎo)致過敏及泌尿和造血功能紊亂等副作用，不容輕視。

高效液相色譜法(HPLC)是最常用的磺胺類藥物含量測(cè)定方法[4-6]，另應(yīng)用較多的方法還有高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)[7-9]、超高效液相色譜-質(zhì)譜法(UPLC-MS)[10-11]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[12]、高效毛細(xì)管電泳法(HPCE)[13]、熒光胺衍生化薄層色譜法( TLC)[14]、流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析法[15]。HPLC法和HPLC-MS法技術(shù)已較成熟，但所需有機(jī)溶劑消耗量大，耗時(shí)長(zhǎng)。雖然GC-MS法靈敏度和特異性高，但衍生過程較繁瑣。薄層色譜的選擇性較好，但靈敏度和重現(xiàn)性較差。

超臨界流體色譜(Supercritical Fluid Chromatography,縮寫為SFC)是一種高效的色譜技術(shù)。SFC兼具氣相色譜和液相色譜的優(yōu)點(diǎn)，既可以分析不適宜使用氣相色譜的高沸點(diǎn)、低揮發(fā)、熱不穩(wěn)定的弱極性化合物，又能分析高效液相色譜法難以純化的強(qiáng)極性化合物。由于超臨界CO2的特性，在樣品開發(fā)時(shí)可以使用正相、反相的不同色譜填料[16]。 本次研究將針對(duì)超臨界流體色譜系統(tǒng)，探索測(cè)定磺胺類藥物 —— 磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲二唑的方法，同時(shí)考察色譜填料、共溶劑種類、共溶劑比例、背壓、流速、柱溫對(duì)樣品保留行為的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：NS8001超臨界流體色譜儀，江蘇漢邦科技有限公司制造；Hedera Si(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Hedera C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Hedera Diol(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Hedera PhenyI(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Hedera CN(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Hedera NH2(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，江蘇漢邦科技有限公司制造。

試劑：磺胺二甲嘧啶(純度99%)，磺胺嘧啶(純度98%)，磺胺甲噁唑(純度98%)，上海寶曼生物科技有限公司制備；磺胺甲二唑(純度98%)，阿拉丁試劑有限公司制備；CO2(純度99.99%)，洪澤寧淮特種氣體有限公司制備；甲醇(純度99.95%)，乙腈(純度99.95%)，江蘇漢邦科技有限公司；乙醇(純度99.95%)，異丙醇，分析純，國(guó)藥試劑有限公司制備。

1.2 樣品配制

取1 mg磺胺甲二唑、2 mg磺胺二甲嘧啶、3 mg磺胺噁唑、1 mg磺胺嘧啶溶解于2 mL甲醇溶液中，混合樣品質(zhì)量濃度為3.5 gL。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 磺胺類藥品混合樣分析

實(shí)驗(yàn)條件：色譜柱，Hedera Si(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相,m(CO2) ∶m(甲醇)=85 ∶15;總流速,3 mLmin;柱溫,40 ℃；操作壓力，12 MPa；檢測(cè)波長(zhǎng)，270 nm；進(jìn)樣體積，2 μL。在此實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)4種磺胺類藥品混合樣進(jìn)行分離，得到分離譜圖(見圖1)。得到的分離結(jié)果見表1。

表1 4種磺胺類藥品混合樣的SFC分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1 — 磺胺甲噁唑; 2 — 磺胺二甲嘧啶; 3 — 磺胺甲二唑; 4 — 磺胺嘧啶。

2.2 樣品重現(xiàn)性分離譜圖

與前述混合樣分析實(shí)驗(yàn)條件相同，進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，RSD值均小于0.2%(見圖2)。

圖2 4種磺胺類藥品混合樣的SFC分離重現(xiàn)性譜圖

2.3 條件改變對(duì)分離度的影響

2.3.1 色譜柱種類

與前述混合樣分析實(shí)驗(yàn)條件相同,將色譜柱填料由Si變?yōu)镃18、Diol、PhenyI、CN和NH2，其他參數(shù)不變，得到SFC分離譜圖(見圖3)。

圖3 不同色譜填料時(shí)4種磺胺類藥品混合樣的SFC分離譜圖

由圖3可知，C18和PhenyI填料對(duì)樣品的保留影響很弱，在3 min內(nèi)4個(gè)樣品被洗脫且有樣品共流出；CN填料保留時(shí)間超過4 min，但4個(gè)樣品共流出；Si和Diol填料保留時(shí)間適中，Si填料實(shí)驗(yàn)中的各個(gè)組分分離度明顯優(yōu)于Diol填料；樣品在NH2填料中保留較多，在10 min內(nèi)只有一種樣品被洗脫。

2.3.2 共溶劑的種類

與前述混合樣分析實(shí)驗(yàn)條件相同,將共溶劑的種類由甲醇變?yōu)橐掖肌⒁译妗惐家约凹状寂c乙腈(1 ∶1)的混合液，其他參數(shù)不變，得到SFC分離譜圖(見圖4)。

由圖4可知，甲醇及甲醇-乙腈(1 ∶1)混合液洗脫能力最強(qiáng)，但甲醇的分離度最好；乙醇、乙腈、異丙醇在10 min內(nèi)均未能將樣品完全洗脫。

2.3.3 共溶劑比例

與前述混合樣分析實(shí)驗(yàn)條件相同，共溶劑甲醇的比例分別為30%、25%、20%、15%、10%，得到SFC分離譜圖(見圖5)。

圖4 不同共溶劑條件下4種磺胺類藥品混合樣的SFC分離譜圖

圖5 不同甲醇比例變化條件下4種磺胺類藥品混合樣的SFC分離譜圖

由圖5可見，共溶劑甲醇比例越大，洗脫能力越強(qiáng)，同時(shí)分離度減小。

2.3.4 背壓

與前述混合樣分析實(shí)驗(yàn)條件相同，背壓在10～18 MPa范圍內(nèi)調(diào)整，得到SFC分離譜圖(見圖6)。

圖6 不同背壓條件下4種磺胺類藥品混合樣的SFC分離譜圖

由圖6可見，背壓對(duì)該樣品保留行為影響較小，背壓增大樣品保留時(shí)間稍有縮短。

2.3.5 流速

圖7 不同流速條件下4種磺胺類藥品混合樣的SFC分離譜圖

由圖7可知，流速越快，洗脫時(shí)間越短。

2.3.6 柱溫

與前述混合樣分析實(shí)驗(yàn)條件相同，柱溫在30～50 ℃范圍內(nèi)調(diào)整，得到SFC分離譜圖(見圖8)。

圖8 不同柱溫條件下4種磺胺類藥品混合樣的SFC分離譜圖

由圖8可見，溫度由低至高，該樣品保留行為差異變小，低溫較高溫下保留時(shí)間減少，低柱溫洗脫能力更強(qiáng)。

3 結(jié) 語

采用NS8001型超臨界流體色譜儀成功優(yōu)化了4種磺胺類藥物的純化方法，同時(shí)考察了色譜填料類型、共溶劑種類、共溶劑比例、背壓、流速、柱溫對(duì)保留行為的影響。實(shí)驗(yàn)表明，色譜填料類型對(duì)保留行為的影響最為明顯，共溶劑種類、共溶劑比例及流速對(duì)保留行為有一定影響。其中，甲醇對(duì)該樣品的分離效果最好，共溶劑比例越高、流速越快，洗脫速度就越快；背壓和柱溫的改變對(duì)該樣品的保留行為影響較小，壓力增大、溫度降低時(shí)洗脫能力增強(qiáng)。優(yōu)化條件下，在7 min內(nèi)可以完成對(duì)4種磺胺類藥物的分離。

[1] CAVALIERE C, CURINI R , CORCIA A D ,et al. A simple and sensitive liquid chromatography-mass spectrometry confirmatory method for analyzing sulfonamide antibacterials in milk and egg[J].J Agric FoodChem, 2003, 51:558-559.

[2] FUH M S, CHU S Y. Quantitative determination of sulfonamide in meat by solid-phase extraction and capillary electrophoresis[J].Anal Chim Acta, 2003,499:215-216.

[3] POSYNIAK A , ZMUDZKI J , MITROWSKA K. Dispersive solid-phase extraction for the determination of sulfonamides in chicken muscle by liquid chromatography[J].J Chromatogr A,2005, 1087:259-260.

[4] 張?zhí)K珍，王益軍，田蘊(yùn)，等. 一種快速檢測(cè)豬肉中五種磺胺類藥物的HPLC方法[J].連云港職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2016,29(3)：1-4.

[5] 陳吉之，閆超.飼料中9種磺胺類藥物的HPLC法快速分離與檢測(cè)[J]. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2015,46(8)：892.

[6] 洪波，羅玲，劉伶俐，等.高效液相色譜-MCX柱凈化分析水產(chǎn)品中磺胺類藥物殘留[J].分析試驗(yàn)室，2013,32(6)：101-102.

[7] 劉佳佳，佘永新，劉洪斌，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定動(dòng)物源性食品中24種磺胺類藥物殘留[J].分析試驗(yàn)室，2011,30(2)：9-11.

[8] 孫偉紅，冷凱良，王志杰，等.HPLC-MSMS內(nèi)標(biāo)法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中18種磺胺類藥物殘留量[J].食品科學(xué)，2009,30(24)：294-295.

[9] 吳宗賢，沈崇鈺，陳慧蘭，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定腸衣中17種磺胺類藥物殘留量[J].分析試驗(yàn)室，2007,26(5)：96-97.

[10] 劉洪斌，姚喜梅，蔡英華，等.UPLC-MSMS檢測(cè)雞蛋中16種磺胺類藥物殘留[J].分析試驗(yàn)室，2015,34(10)：1141-1143.

[11] 李寧，樊建麟，楊東順，等.QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定牛奶和奶粉中13種磺胺類藥物[J].分析試驗(yàn)室，2015,34(7)：783-784.

[12] TARBIN J A , CLARKE P, SHEARER G. Screening of sulphonamides in egg using gas chromatography-mass-selective detection and liquid chromatography-mass spectrometry[J].J Chromatogr B, 1999,729:127-129.

[13] 蘇曉紅，檀華蓉，沈虎琴，等.高效毛細(xì)管電泳法同時(shí)分離檢測(cè)土壤中三嗪類與磺胺類抗球蟲藥物的研究[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2013,32(2)：156-157.

[14] 安登魁，程景才，談亞珠，等.系統(tǒng)差值信息量分類法的探討Ⅱ：22種磺胺類藥物的56種 TLC 系統(tǒng)的最佳選取[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1982(2)：14-15.

[15] 何云華，祝興華，呂九如，等.流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析法測(cè)定三類磺胺類藥物[J].分析試驗(yàn)室，2006,25(1)：69-71.

[16] 朱玲玲，趙陽，孫欣光，等.超臨界流體色譜在天然產(chǎn)物分離分析中的應(yīng)用進(jìn)展[J].藥物分析雜志，2016,36(8)：1317-1318.

ApplicationofaNewSupercriticalFluidChromatographSysteminSulfonamidesAnalysis

CHENHai1LIShengying1LIUDawei1ZHANGDabing1YOUHuiyan1,2

(1. Jiangsu Hanbon Science and Technology Co. Ltd., Huai'an Jiangsu 223005, China;2. College of Environmental and Chemical Engineering, Dalian University, Dalian Liaoning 116622, China)

A new supercritical fluid chromatograph system was used to separate 4 sulfonamides within 7minutes, under the optimized condition, to study the impact of chromatographic filler type, solvent type, solvent ratio, back pressure, flow rate and column oven temperature on the retention behavior. The experiments showed that the effect of chromatographic filler type on the retention behavior is most obvious; normal phase silica gel column is most suitable for this kind of separation. The co-solvent species, co- solvent ratio and flow rate all have influence on retention behavior, in which methanol is most suitable for the separation of the sample. The higher co-solvent ratio and faster flow rate, the shorter the elution time is. The change of back pressure and column oven temperature has little influence on the retention behavior of the sample.

supercritical fluid chromatography; sulfonamides; optimization; retention behavior

2017-09-26

國(guó)家科技攻堅(jiān)計(jì)劃、國(guó)家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)“超臨界流體色譜儀的研制與應(yīng)用開發(fā)”(2013YQ170525)

陳海(1989 — ),男, 實(shí)驗(yàn)員,研究方向?yàn)槌R界流體色譜。

O657

A

1673-1980(2017)06-0068-04