藻藍(lán)蛋白皮膚毒性實(shí)驗(yàn)研究*

劉 琪 吳中英 焦緒棟 劉 冰 李文軍

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藻藍(lán)蛋白皮膚毒性實(shí)驗(yàn)研究*

劉 琪1吳中英2焦緒棟1劉 冰1李文軍1①

(1. 中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所 海岸帶生物學(xué)與生物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 煙臺 264003; 2. 山東群英醫(yī)學(xué)有限公司, 煙臺 264005)

藻藍(lán)蛋白是藍(lán)藻中的一種主要活性成分, 研究發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白有多種功能, 可以清除氧自由基, 且含有多種氨基酸能夠抗衰老、抗過敏, 為對藻藍(lán)蛋白用于化妝品行業(yè)的可行性進(jìn)行探究, 本文采用新西蘭白兔作為動(dòng)物模型, 通過光毒性、急性經(jīng)皮毒性以及皮膚變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn), 驗(yàn)證其對皮膚的毒性作用。結(jié)果顯示, 藻藍(lán)蛋白對白兔沒有明顯的毒性作用, 也未引起皮膚過敏反應(yīng), 為其在美容化妝方面的應(yīng)用提供了參考。

藻藍(lán)蛋白; 抗氧化; 光毒性實(shí)驗(yàn); 急性經(jīng)皮毒性實(shí)驗(yàn); 皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn); 化妝品

作為海洋中一種重要的天然資源, 海藻植物近幾年得到國內(nèi)外眾多研究者的青睞。通過對其化學(xué)組成成分開展研究, 發(fā)現(xiàn)藻類中含有豐富的生物活性物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì), 包括多糖類、蛋白類、多酚類、甾醇類等(韓玲等, 2013)。藻藍(lán)蛋白(phycocyanin, PC)也稱為藻藍(lán)素, 主要存在于藍(lán)藻中, 是一種天然的營養(yǎng)素。它屬于捕光色素蛋白藻膽蛋白的一種, 分子量一般為30kD左右, 由兩個(gè)亞基構(gòu)成, 其載體蛋白以共價(jià)鍵形式連接開鏈吡咯發(fā)色團(tuán), 因此能夠高效捕獲光能, 吸收光譜為615~ 640nm, 為藻類的光合作用提供能源(Eriksen, 2008)。藻藍(lán)蛋白可以從螺旋藻(spp.)中提取, 通過磷酸鹽緩沖液凍融和超聲破碎、硫酸銨沉淀獲得藻藍(lán)蛋白粗提液, 再經(jīng)過兩次羥基磷灰石柱(hydroxyapatite, HA)層析得到純度較高的藻藍(lán)蛋白。據(jù)研究, 藻藍(lán)蛋白具有多種生物功能, 包括抗凝血(Sheih et al., 2009)、抑制炎癥、調(diào)節(jié)免疫抗氧化、抗過敏以及抗腫瘤等(Sheih et al., 2010; Liu et al., 2015; Ravi et al., 2015; Wuet al., 2016)。同時(shí), 因具有水溶性強(qiáng)、無毒、著色好且含大量易于吸收的氨基酸等優(yōu)勢特性, 藻藍(lán)蛋白已被廣泛應(yīng)用于食品著色劑、保健品以及動(dòng)物飼料中(Martelli,et al., 2014; El Bakyet al., 2015)。

由于海藻天然無毒, 富含多種營養(yǎng)成分, 近幾年已逐步被應(yīng)用于化妝品領(lǐng)域。同樣作為天然色素的藻紅蛋白也被作為化妝品的配方應(yīng)用于天然粉色和紫色的口紅、眼線的著色劑研發(fā)(夏亞穆等, 2014)。然而, 將藻藍(lán)蛋白應(yīng)用于化妝品領(lǐng)域的研究很少。國內(nèi)外相關(guān)研究發(fā)現(xiàn), 天然的藻藍(lán)蛋白具有清除羥基和H2O2等自由基的能力, 顯示出抗衰老的功效(Lissiet al., 2000; Chen and Huang,2006; Chu et al., 2010; Liet al., 2016)。在眾多衰老理論中, 自由基促進(jìn)衰老已成為大多數(shù)研究者所公認(rèn)的事實(shí)(Junjaudet al., 2006)。自由基和活性氧是有氧代謝過程中生化反應(yīng)產(chǎn)生的高活性分子, 具有很強(qiáng)的反應(yīng)活性。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)缺乏有效的抗氧化防御機(jī)制時(shí), 氧化劑便會(huì)破壞細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)分子, 如DNA、蛋白質(zhì)等, 最終造成機(jī)體損傷和衰老(Cookeet al., 2003)。由于合成抗氧化劑具有一些毒性副作用, 因此天然來源的抗氧化劑藻藍(lán)蛋白, 作為化妝品抗衰老活性成分將具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

本文基于新西蘭白兔模型, 將藻藍(lán)蛋白作為化妝品應(yīng)用于皮膚表面, 通過光毒性、急性經(jīng)皮毒性以及皮膚變態(tài)反應(yīng)的實(shí)驗(yàn), 測定藻藍(lán)蛋白對皮膚的毒性作用, 旨在探討天然抗氧化劑——藻藍(lán)蛋白用于化妝品研發(fā)的可行性, 為進(jìn)一步開發(fā)新型的專一型或復(fù)合型無毒性抗衰老的化妝美容產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物和試劑

健康合格新西蘭白兔66只, 雌雄各半, 體重為2.6~2.8kg(購于煙臺拉斐爾生物科技有限公司)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用常規(guī)飼料喂養(yǎng), 自由飲水, 室溫20~26°C, 日溫差≤4°C, 相對濕度40%~70%, 采用時(shí)控開關(guān)自動(dòng)控制照度, 明暗交替時(shí)間為12h∶12h, 每日更換托盤。動(dòng)物飼養(yǎng)于不銹鋼籠具中, 每籠1只。實(shí)驗(yàn)前, 在此條件下飼養(yǎng)5天以適應(yīng)環(huán)境, 實(shí)驗(yàn)期間給藥劑量為2000mg/kg, 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將動(dòng)物進(jìn)行安樂死處理。

藻藍(lán)蛋白(購自新大澤螺旋藻有限公司, 純度為3.2, 用A620/A280表示), 純凈水(購自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司), 肉桂醛(購自廣東翁江化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

飛利浦褪毛器、艾科UV輻照儀用于動(dòng)物模型制備; 德國徠卡EG1150組織包埋機(jī)用于組織包埋; 德國徠卡rm2235切片機(jī)用于切片; 日本VIP6櫻花組織脫水機(jī)用于組織脫水; 日本奧林巴斯顯微鏡CCD成像系統(tǒng)(DP21)用于觀察并拍攝病理切片圖片。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法及測試

1.3.1 光毒性試驗(yàn) 取新西蘭白兔6只, 雌雄各半, 在進(jìn)行光毒性測試之前的18~24h, 將動(dòng)物脊柱兩側(cè)皮膚去毛, 試驗(yàn)部位皮膚需完好, 無損傷及異常。備4塊去毛區(qū)(見圖1), 每塊去毛面積約為2cm×2cm。將動(dòng)物固定, 在動(dòng)物去毛區(qū)1和2涂敷0.2mL受試物。單次給藥, 經(jīng)皮涂敷, 30min后, 左側(cè)(去毛區(qū)1和3)用鋁箔覆蓋, 用膠帶固定, 右側(cè)使用UV進(jìn)行輻照。分別于輻照后1、24、48和72h觀察皮膚反應(yīng), 根據(jù)表1判定每只動(dòng)物皮膚反應(yīng)評分(林靜吟, 2010)。

圖1 動(dòng)物皮膚去毛區(qū)位置示意圖

注: 1. 涂受試物、無照射; 2. 涂受試物、照射; 3. 不涂受試物、不照射; 4. 不涂受試物、照射。

表1 皮膚刺激反應(yīng)評分

1.3.2 急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn) 取30只新西蘭白兔, 按體重隨機(jī)分為3組(每組10只個(gè)體), 設(shè)為空白對照組、溶媒對照組、藻藍(lán)蛋白組。在試驗(yàn)期間, 記錄各組動(dòng)物的日觀察指標(biāo)及飲水量、進(jìn)食量, 體重和增長率、死亡率。試驗(yàn)開始前24h剔除背部被毛, 暴露出約10cm× 16cm的皮膚擬染毒區(qū)?？瞻讓φ战M僅做褪毛處理, 溶媒對照組噴涂純凈水, 藻藍(lán)蛋白組以劑量2000mg/kg均勻涂敷受試物。將藻藍(lán)蛋白與純凈水配制成可涂敷的膠狀, 將受試物均勻涂敷于背部皮膚染毒區(qū), 用薄膠片覆蓋并用無刺激膠布固定, 24h后染毒結(jié)束, 用純凈水清除殘留受試物, 觀察14天并記錄。觀察期結(jié)束后進(jìn)行剖檢, 對涂抹部位的皮膚進(jìn)行病理組織學(xué)分析。

1.3.3 皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn) 取30只新西蘭白兔, 按體重隨機(jī)分為3組(每組10只個(gè)體), 設(shè)為空白對照組、肉桂醛對照組、藻藍(lán)蛋白組。同上剔除背部左側(cè)被毛, 暴露出約10cm× 8cm的皮膚擬左側(cè)染毒區(qū), 肉桂醛對照組噴涂1%肉桂醛。藻藍(lán)蛋白組以劑量2000mg/kg均勻涂敷。

(1) 誘導(dǎo)接觸階段: 將受試物均勻涂敷于背部皮膚左側(cè)染毒區(qū)后用薄膠片覆蓋, 無刺激膠布固定6小時(shí)、第7天和第14天以同樣方法重復(fù)一次, 空白對照組在此階段僅以純凈水涂敷。

(2) 激發(fā)接觸階段: 末次誘導(dǎo)后14d, 同樣暴露出約10cm×8cm的皮膚擬右側(cè)染毒區(qū), 將約0.2mL的受試物涂于皮膚右側(cè)染毒區(qū), 用一層薄膠片覆蓋, 固定6h, 空白對照組在此階段涂以受試物。激發(fā)接觸后24h和48h使用純凈水清除殘留受試物。觀察皮膚反應(yīng), 按化妝品標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。若出現(xiàn)皮膚反應(yīng)積分≥2時(shí), 判為該動(dòng)物出現(xiàn)皮膚變態(tài)反應(yīng)陽性, 按化妝品標(biāo)準(zhǔn)判定受試物的致敏強(qiáng)度。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理 采用SPSS軟件比較各組間的差異, 利用檢驗(yàn)判斷差異是否顯著。結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 以<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 光毒性

當(dāng)單純涂受試物且非照射區(qū)域未出現(xiàn)皮膚反應(yīng), 而涂受試物后經(jīng)照射的區(qū)域出現(xiàn)皮膚反應(yīng)分值之和≥2的動(dòng)物數(shù)≥1只時(shí), 判為受試物具有光毒性。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示, 藻藍(lán)蛋白在2000mg/kg劑量下, 未觀察到對新西蘭白兔有明顯的光毒毒性反應(yīng), 說明藻藍(lán)蛋白作為化妝品外涂時(shí)不具有光毒性。

2.2 急性經(jīng)皮毒性

在整個(gè)試驗(yàn)期間, 各組動(dòng)物均未出現(xiàn)死亡情況, 并且每次觀察指標(biāo)及飲水量、進(jìn)食量也沒有明顯異常。與對照組比較, 藻藍(lán)蛋白組白兔的體重和體重增長率未見有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異, 見表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 對白兔進(jìn)行剖檢, 通過肉眼觀察未發(fā)現(xiàn)各器官有組織異?，F(xiàn)象。進(jìn)一步對各組給藥部位作切片染色, 進(jìn)行病理學(xué)檢查, 均未發(fā)現(xiàn)明顯的異常狀態(tài)(圖2)。

表2 藻藍(lán)蛋白經(jīng)皮給藥對新西蘭白兔體重增長率的影響(急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn))

注: 單位kg(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)。

圖2 對照組(a)和藻藍(lán)蛋白組(b)的皮膚組織病理切片對比

2.3 皮膚變態(tài)反應(yīng)

在皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)期間, 各組動(dòng)物體重和體重增長率與對照組相比也未見有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表3)。在藻藍(lán)蛋白為2000mg/kg的給藥劑量下, 新西蘭白兔的皮膚未見變態(tài)反應(yīng)(圖3)。而肉桂醛對照組能顯著引起新西蘭白兔變態(tài)反應(yīng), 皮膚變態(tài)反應(yīng)積分≥2的動(dòng)物有4只, 占實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物數(shù)的40%, 中等致敏強(qiáng)度; 藻藍(lán)蛋白組和空白對照組均未見變態(tài)反應(yīng), 皮膚變態(tài)反應(yīng)積分<2, 與肉桂醛對照組相比差異顯著(<0.05)(表4)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 反復(fù)接觸藻藍(lán)蛋白不會(huì)引起新西蘭白兔皮膚出現(xiàn)紅斑和水腫等過敏反應(yīng)。將對空白組、肉桂醛對照組和藻藍(lán)蛋白組給藥部位作切片染色, 進(jìn)行病理學(xué)檢測, 結(jié)果表明相對于肉桂醛對照組, 藻藍(lán)蛋白組未見明顯異常(圖4)。

表3 藻藍(lán)蛋白經(jīng)皮給藥對新西蘭白兔體重增長率的影響(皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn))

注: 單位kg(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)。

表4 藻藍(lán)蛋白對新西蘭白兔皮膚變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對藻藍(lán)蛋白用作化妝品的可行性進(jìn)行了初步探究, 測試了其對動(dòng)物模型的毒性作用。研究發(fā)現(xiàn), 當(dāng)藻藍(lán)蛋白在2000mg/kg劑量下涂抹于新西蘭白兔的皮膚表面時(shí), 對新西蘭白兔均未觀察到明顯的光毒性、急性經(jīng)皮毒性以及皮膚變態(tài)反應(yīng)等毒副作用。但其結(jié)果是否能夠外推到人類化妝品的有效性, 仍需與其他毒性試驗(yàn)結(jié)果相結(jié)合分析, 進(jìn)行綜合評價(jià)。目前, 已有很多研究證實(shí)了藻藍(lán)蛋白的抗氧化活性以及清除自由基能力使其具有較強(qiáng)的抗衰老作用。正常人體內(nèi)存在著超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSHPX)等氧化防御體系, 可以對抗氧化應(yīng)激反應(yīng), 清除體內(nèi)產(chǎn)生的高活性自由基, 從而起到抗衰老的作用, 但是隨著老齡化, 免疫器官不斷萎縮, 機(jī)體免疫抗衰老功能便會(huì)逐漸減弱。而藻藍(lán)蛋白擁有良好的抗氧化能力, 它的出現(xiàn)或許將會(huì)成為新一代的抗衰老產(chǎn)品。Chu等(2010)從螺旋藻類中提取了包含藻藍(lán)蛋白的水溶物, 利用小鼠細(xì)胞研究其清除自由基的抗氧化能力, 結(jié)果表明藻藍(lán)蛋白對自由基誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用, 而Niraj課題組則選擇了線蟲模型來測試藻藍(lán)蛋白對線蟲的抗衰老作用以及對內(nèi)穩(wěn)態(tài)蛋白質(zhì)的抑制作用(Singhet al., 2015)。Harishkumar等人還研究了藻藍(lán)蛋白在傷口愈合過程中對生長因子和細(xì)胞遷移的影響(Li et al., 2016)。最近, Castangia等(2016)克服了生物利用度問題, 將藻藍(lán)蛋白成功封裝入膠囊, 體外滲透實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這樣更有利于藻藍(lán)蛋白沉積在皮膚的深層, 從而改進(jìn)了藻藍(lán)蛋白對人類角質(zhì)細(xì)胞的抗氧化活性, 這些研究都表明藻藍(lán)蛋白具有在體內(nèi)外作為抗氧化劑抵抗衰老的潛力。

圖3 空白組(a), 肉桂醛組(b)和藻藍(lán)蛋白組(c)的新西蘭白兔皮膚對比

圖4 空白組(a)、肉桂醛組(b)和藻藍(lán)蛋白組(c)的皮膚組織病理切片

4 結(jié)論與展望

總而言之, 藻藍(lán)蛋白能否大規(guī)模地用于美容駐顏以及化妝品行業(yè), 取決于其是否具備良好的品質(zhì)控制。我國對藻類蛋白質(zhì)的開發(fā)利用時(shí)間較短, 大多還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段, 應(yīng)用開發(fā)正在起步。因此, 藻種的選育、分離、提取、純化工藝的改善, 活性成分的穩(wěn)定, 涂面、口服和注射等給藥途徑的優(yōu)化, 以及確定藻藍(lán)蛋白的有效成分是其整體還是其代謝產(chǎn)物, 是我們未來需要進(jìn)一步研究的重點(diǎn)內(nèi)容?；谝陨系难芯? 藻藍(lán)蛋白在化妝品領(lǐng)域亦具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Experimental Study of Dermal Toxicity of Phycocyanin

LIU Qi1, WU Zhong-Ying2, JIAO Xu-Dong1, LIU Bing1, LI Wen-Jun1*

(1.Key Laboratory of Coastal Biology and Biological Resource Industry,Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China; 2. Shandong Qunying Medicine Co. Ltd., Yantai 264005, China)

Phycocyanin is one of the main active compounds present in cyanobacteria. It has multiple functions, such as scavenging oxygen free radicals, and it has anti-aging and anti-allergy properties that are manifested in combination with a variety of amino acids. In order to study the feasibility of using phycocyanin in the cosmetics industry, we consider the New Zealand rabbits as the model animal and conduct experiments such as light toxicity, acute dermal toxicity, and skin allergy tests to verify its toxic effects on the skin of the rabbit. The results show no obvious toxicity and no allergic reactions to the skin of the rabbits. These results provide a reference for the application of phycocyanin in the fields of cosmetology and makeup.

phycocyanin; antioxidant; light toxicity; acute percutaneous toxicity; skin allergy; cosmetics

TQ041

10.12036/hykxjk20170317001

海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(20120527); 中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)(XDA1102040300); 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41176144, 41376139); 國家科技支撐計(jì)劃(2013BAB01B01); 煙臺市科技計(jì)劃(2016JHZB007)資助。劉 琪, 女, 碩士研究生, 從事海洋生物藥學(xué)研究, E-mail: 911148824@qq.com

李文軍, 男, 助理研究員, 從事海洋生物藥學(xué)研究, E-mail: liwenjun332@163.com

2017-03-17,

2017-06-21