同型半胱氨酸試劑檢測(cè)的性能驗(yàn)證

帥奉飛，毛萬成，田敏

（思南縣人民醫(yī)院，貴州 思南 565100）

臨床研究

同型半胱氨酸試劑檢測(cè)的性能驗(yàn)證

帥奉飛，毛萬成，田敏

（思南縣人民醫(yī)院，貴州 思南 565100）

目的分析探討北京九強(qiáng)（循環(huán)酶法）同型半胱氨酸在貝克曼AU680全自動(dòng)生化分析儀上檢測(cè)的性能驗(yàn)證。方法依據(jù)CLSI-EP相關(guān)文件，在AU680生化分析儀上對(duì)該試劑盒的準(zhǔn)確度、重復(fù)性、線性、靈敏度、特異性、精密度、臨床可報(bào)告范圍、回收實(shí)驗(yàn)等方面進(jìn)行性能評(píng)價(jià)。結(jié)果準(zhǔn)確度偏差＜5.48%、重復(fù)性CV＜2.09%、線性R2=0.999,6、靈敏度=0.379,6、批內(nèi)精密度（CV）為1.34%、批間精密度（CV）為1.31%；線性范圍1.5 μmol/L-50 μmol/L，最大稀釋倍數(shù)為8，臨床可報(bào)告范圍1.5 μmol/L-400 μmol/L；抗壞血酸＜20 mg/dL、血紅蛋白＜1,200 mg/dL、膽紅素＜20 mg/dL、甘油三酯＜2,500 mg/dL，對(duì)試驗(yàn)無明顯干擾、回收率101.7%。結(jié)論北京九強(qiáng)（循環(huán)酶法）同型半胱氨酸在貝克曼AU680全自動(dòng)生化儀上的分析性能良好，可用于臨床檢測(cè)。

同型半胱氨酸；試劑；性能驗(yàn)證；檢測(cè)

同型半胱氨酸（Hcy）是一種含基的氨基酸，主要來源于飲食攝取額度蛋氨酸，是蛋氨酸和半胱氨酸代謝過程中一個(gè)重要的中間產(chǎn)物，其本身并不參加蛋白質(zhì)的合成。Hcy最直接的危害是損傷血管，對(duì)血管內(nèi)皮產(chǎn)生毒素，參與動(dòng)脈粥樣的產(chǎn)生和斑塊形成等，是心腦血管疾病的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，高Hcy水平可以反映相關(guān)疾病的危險(xiǎn)程度[1]近年來，隨著循環(huán)酶法檢測(cè)同型半胱氨酸試劑盒大量上市，我們申報(bào)的“Hcy與炎性反應(yīng)的相關(guān)性”作為國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目的一個(gè)子課題，為了使我們實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的Hcy結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，本研究特對(duì)我們使用的北京九強(qiáng)循環(huán)酶法同型半胱氨酸在AU680全自動(dòng)生化儀上檢測(cè)性能進(jìn)行了詳細(xì)分析。

1 材料與方法

1.1 評(píng)價(jià)系統(tǒng)

1.1.1 儀器 貝克曼AU680全自動(dòng)生化分析儀。

1.1.2 試劑 同型半胱氨酸檢測(cè)試劑盒HCY批號(hào)：16-0816（北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司）；校正血清：GCHCY，批號(hào)：16-0816；質(zhì)控血清：GQ-HCY/2，批號(hào)：16-0418；實(shí)驗(yàn)基質(zhì)：檢驗(yàn)科混合血清，干擾試驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)材料：VC 500 mg/dL；血紅蛋白10,000 mg/dL；膽紅素500 mg/dL；甘油三酯20,000 mg/dL。

1.1.3 檢測(cè)原理 Hcy在Hcy甲基轉(zhuǎn)移酶及S-腺苷Hcy水解酶的共同作用下循環(huán)放大，同時(shí)產(chǎn)生腺苷。腺苷被水解成氨和次黃苷，氨在谷氨酸脫氫酶催化下使NADH轉(zhuǎn)化成NAD+，在340 nm處檢測(cè)反應(yīng)吸光度，其變化率與Hcy的濃度成正比。

1.1.4 檢測(cè)參數(shù) 采用兩點(diǎn)速率法，主波長(zhǎng)340 nm，樣本13 UI，R1試劑240 UI，R2試劑65 UI。

1.2 樣本 本院門診、住院患者及健康體檢者的血清樣本。

1.3 方法及指標(biāo)判定 每天先測(cè)定2個(gè)水平質(zhì)控品，按實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控規(guī)則（1.3 s、2.2 s）進(jìn)行質(zhì)控，在控后再進(jìn)行試劑性能評(píng)價(jià)。性能評(píng)價(jià)指標(biāo)：依據(jù)CLSI-EP相關(guān)文件，在AU680生化儀上對(duì)北京九強(qiáng)循環(huán)酶法Hcy測(cè)定試劑盒進(jìn)行準(zhǔn)確度、重復(fù)性、線性、靈敏度、特異性、精密度、臨床可報(bào)告范圍、回收實(shí)驗(yàn)等方面進(jìn)行性能評(píng)價(jià)，并與試劑廠家聲明的參數(shù)進(jìn)行比較。

1.3.1 準(zhǔn)確性 質(zhì)控血清：GQ-HCY/2，批號(hào)：16-0418，測(cè)三次，計(jì)算其偏差，準(zhǔn)確性偏差應(yīng)不超過±10%。

1.3.2 重復(fù)性 測(cè)定檢驗(yàn)科混合血清，重復(fù)測(cè)定20次，重復(fù)性的變異系數(shù)CV應(yīng)≤10%；

1.3.3 線性 留取高值樣本，按照濃度梯度1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32倍比稀釋，重復(fù)三次，取平均值，最后做出線性曲線，要求R2≥0.99。

1.3.4 靈敏度 連續(xù)檢測(cè)去離子水10次，計(jì)算測(cè)值的平均值，SD，以平均值+3＊SD對(duì)應(yīng)的濃度為試劑的分析靈敏度。

1.3.5 干擾試驗(yàn)（特異性） 以檢驗(yàn)科的混合血清為基質(zhì)，添加干擾物后檢測(cè)，在病人混合血清180 μL中分別加入甘油三酯、膽紅素、血紅蛋白、VC干擾物，干擾物濃度梯度為1、1/2、1/4、0，再分別測(cè)定樣本值，分析添加干擾物后測(cè)量的偏差；判斷標(biāo)準(zhǔn)：與平均值作比較，干擾物測(cè)值偏差不超過±10%視為無干擾。

1.3.6 精密度 連續(xù)5天測(cè)定檢驗(yàn)科混合血清，每天測(cè)定4次，批內(nèi)精密度，批間精密度，變異系數(shù)CV應(yīng)≤10%。

1.3.7 臨床可報(bào)告范圍驗(yàn)證 選擇高值樣本，分別做不同倍數(shù)的稀釋，稀釋后測(cè)量值與理論值間的偏差應(yīng)在±10%以內(nèi)，用線性乘以最大稀釋倍數(shù)得出的數(shù)值即為可報(bào)告范圍上線。

1.3.8 回收率驗(yàn)證 用5%的高濃度樣本加入到95%的低濃度基質(zhì)血清中混勻檢測(cè)，并計(jì)算其理論值，測(cè)量值與理論值間偏差不超過10%。

2 結(jié)果

2.1 干擾試驗(yàn)分析結(jié)果 見表1。

2.2 Hcy試劑在貝克曼AU680全自動(dòng)生化分析儀上檢測(cè)的性能驗(yàn)證結(jié)果 驗(yàn)證指標(biāo)判定標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證結(jié)果：準(zhǔn)確性：GQ-HCY/2，批號(hào)：16-0418，靶值12.22，偏差=5.48%；重復(fù)性：檢驗(yàn)科混合血清，重復(fù)測(cè)定20次，計(jì)算CV，CV=2.09%；線性留取高值樣本，按照濃度梯度1、1/2、1/4， 1/8、1/16、1/32倍比稀釋，重復(fù)三次，取平均值，做出線性曲線，求出R2，R2=0.999,6；靈敏度：水為樣品檢測(cè)10次后，計(jì)算均值+3SD的濃度，靈敏度=0.379,6；特異性抗壞血酸≤20 mg/dL，膽紅素≤20 mg/dL，紅蛋白≤1,200 mg/dL，甘油三酯≤2,500 mg/dL，對(duì)HCY均無影響，偏差不超過±10%，血各項(xiàng)偏差都在±10%以內(nèi)；精密度：連續(xù)5天測(cè)定檢驗(yàn)科混合血清，每天測(cè)定4次，批內(nèi)、批間精密度的變異系數(shù)CV應(yīng)≤10%，批間精密度CV=1.31%；臨床可報(bào)用高值樣本，分別做不同倍數(shù)的稀釋，稀釋后臨床可報(bào)告測(cè)量值與理論值間的偏差在±10%以內(nèi)的最大稀釋倍數(shù)乘以線性得出可報(bào)告圍上線，稀釋后臨床可報(bào)告范圍為：1.5 μmol-400 μmol；回收率：以5%的高濃度樣本加入到95%的低濃度基質(zhì)血清中混勻檢測(cè)，并計(jì)算其理論值，測(cè)量值與理論值間偏差不超過10%，回收率為：101.73%。

表1 同型半胱氨酸循環(huán)酶法干擾試驗(yàn)因素分析

2.3 結(jié)論 根據(jù)CLSI-EP相關(guān)文件及國(guó)家衛(wèi)生行業(yè)有關(guān)判定標(biāo)準(zhǔn)[2]，同型半胱氨酸檢測(cè)試劑盒（北京九強(qiáng)）各項(xiàng)性能指標(biāo)符合標(biāo)準(zhǔn)要求，性能驗(yàn)證通過。

3 討論

Hcy為含巰基氨基酸，是胱硫醚和蛋氨酸轉(zhuǎn)硫化和甲基化代謝旁路中形成的中間體。80%的Hcy在血中通過二硫鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合，只有很少一小部分游離Hcy參加循環(huán)。自20世紀(jì)60年代初在尿中首次被發(fā)現(xiàn)以來，Hcy被認(rèn)為與多種先天性代謝缺陷有關(guān)，如胱硫醚β合成酶缺乏是已知的造成高同型半胱氨酸尿癥的原因。

最近，人們又發(fā)現(xiàn)高同型半胱氨酸血癥是發(fā)生外周血管、腦血管和冠狀動(dòng)脈血管疾病的危險(xiǎn)因素之一。隨著研究的深入，血漿Hcy作為心腦血管病尤其是腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因子的地位已經(jīng)得到確立。鑒于我國(guó)腦卒中發(fā)病率（250/10萬）明顯高于國(guó)外，故有學(xué)者提出了“H”型高血壓的概念，強(qiáng)調(diào)在控制血壓的同時(shí)，還要控制高同型半胱氨酸血癥。國(guó)外的HOPE-2再研究已確認(rèn)葉酸預(yù)防腦卒中有效，其中65%的患者合并了ACEI類藥物使腦卒中風(fēng)險(xiǎn)顯著下降25%。國(guó)內(nèi)亦有學(xué)者使用依那普利加葉酸片控制伴有Hcy升高的高血壓病患者，并取得良好效果。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，Hcy批內(nèi)精密度（CV）為1.34%，批間精密度（CV）為1.31%遠(yuǎn)低于國(guó)際公認(rèn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（允許精密度小于6%）[3]，用高值樣本進(jìn)行倍比稀釋上機(jī)檢測(cè)求R2=0.999,6，高于衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的0.995要求，故完全能滿足性線要求。在做回收實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，最開始定標(biāo)是用的北京九強(qiáng)Hcy試劑盒自帶的兩點(diǎn)定標(biāo)校準(zhǔn)品進(jìn)行校準(zhǔn)后，做回收實(shí)驗(yàn)，計(jì)算出回收率都在200%左右，向廠家提出要求解決，最后通過分析可能是由于定標(biāo)原因，及時(shí)更換了六點(diǎn)定標(biāo)液，由以前的兩點(diǎn)定換成了六點(diǎn)定標(biāo)，再做回收試驗(yàn)，其結(jié)果為101.73%，回收試驗(yàn)在可控范圍內(nèi)，參照文獻(xiàn)分析其原因[4]，兩點(diǎn)定標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比多點(diǎn)定標(biāo)檢測(cè)結(jié)果比較，用兩點(diǎn)定標(biāo)曲線檢測(cè)的結(jié)果偏差較大，不能滿足檢測(cè)要求。兩點(diǎn)定標(biāo)和多點(diǎn)定標(biāo)的區(qū)別在于，兩點(diǎn)定標(biāo)曲線是一條直線，而多點(diǎn)定標(biāo)則是一條曲線，做回收試驗(yàn)低值標(biāo)本和高值標(biāo)本混合后檢測(cè)，導(dǎo)致兩種定標(biāo)方法所做結(jié)果差異較大。故將該試劑盒換成六點(diǎn)定標(biāo)后的批內(nèi)精密度、批間精密度、線性和回收率均達(dá)到要求[5]。

循環(huán)酶法是目前臨床測(cè)定血清Hcy最新的一種化學(xué)方法，與以前免疫、電泳、色譜等方法相比，更具有操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，線性范圍寬，抗干擾因素強(qiáng)，精密度較好，可自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，隨著對(duì)同型半胱氨酸的臨床研究的深入，其定量測(cè)定意義越來越受到重視，因此本實(shí)驗(yàn)采用一系列較為簡(jiǎn)化且合理的方法對(duì)其進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)[6,7]，為保證檢測(cè)結(jié)果的正確可靠有著十分重要的臨床意義。

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