微量分光光度計(jì)的校準(zhǔn)方式

張永臣 張蕊 / 黑龍江省計(jì)量檢定測(cè)試院

微量分光光度計(jì)的校準(zhǔn)方式

張永臣 張蕊 / 黑龍江省計(jì)量檢定測(cè)試院

0 引言

微量分光光度計(jì)的出現(xiàn)解決了微量樣品采用分光法定性及定量測(cè)試的問(wèn)題?；诖颂攸c(diǎn)，該類儀器被廣泛用于生物、醫(yī)學(xué)等檢測(cè)樣本量稀少并且價(jià)格昂貴的領(lǐng)域。微量分光光度計(jì)屬于分光光度計(jì)類測(cè)試儀器，遵循朗伯比爾定律，但較普通的分光光度計(jì)還是有很大的改進(jìn)。隨著儀器使用量的增多，不得不考慮該類儀器的溯源性問(wèn)題。2015年相關(guān)部門提出并計(jì)劃編制該類儀器的校準(zhǔn)規(guī)范，但至今還未出版正式的國(guó)家校準(zhǔn)規(guī)范。本文針對(duì)微量分光光度計(jì)的測(cè)試原理和功能特點(diǎn)，分別對(duì)兩種校準(zhǔn)方式進(jìn)行了探討，并提出了建議。

1 微量分光光度計(jì)的測(cè)試原理及功能特點(diǎn)

微量分光光度計(jì)的獨(dú)特之處在于它對(duì)測(cè)試樣品量的要求非常低，現(xiàn)有的儀器中可測(cè)量最低為0.3 μL的樣品，可以節(jié)省非常稀少且昂貴的樣品量。檢測(cè)波長(zhǎng)范圍200～1 000 nm，多數(shù)儀器設(shè)定了定點(diǎn)測(cè)試波長(zhǎng)230 nm、260 nm和280 nm，便于DNA、RNA和蛋白質(zhì)的測(cè)試。采用發(fā)光穩(wěn)定且不需預(yù)熱的氙燈代替鎢燈和氘燈作為光源，壽命更長(zhǎng)，光強(qiáng)更大。該類儀器中精度稍高的都在使用電感耦合陣列檢測(cè)器（CCD），其光譜范圍、量子效率、信噪比等指標(biāo)都遠(yuǎn)高于光電二極管陣列。

使用該類儀器多用其基座檢測(cè)模式，該功能是實(shí)現(xiàn)微量測(cè)試的關(guān)鍵技術(shù)。即，用微量移液槍吸取樣品滴加在檢測(cè)基座上，基座上包埋了一根接受光纖，放下檢測(cè)臂與液體接觸，檢測(cè)臂上有檢測(cè)光纖，應(yīng)用液體的表面張力在檢測(cè)基座和檢測(cè)臂之間自動(dòng)形成標(biāo)準(zhǔn)液柱。液柱高度相當(dāng)于光程，液柱高度可設(shè)定為0.05 nm、0.1 nm、0.5 nm等。光源發(fā)出的光經(jīng)過(guò)光纖傳導(dǎo)并通過(guò)液柱由檢測(cè)器接受并進(jìn)行一系列的計(jì)算。其過(guò)程如圖1～3所示。

圖1 取樣滴加

圖2 樣品滴加在檢測(cè)基座上

圖3 形成標(biāo)準(zhǔn)液柱

與普通的分光光度計(jì)相比，從點(diǎn)樣到測(cè)試完成的時(shí)間大大縮短，且省去了清洗比色皿的程序。該檢測(cè)基座只需用拭鏡紙擦拭即可。該類儀器可以實(shí)現(xiàn)的檢測(cè)功能如下：普通的紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)、DNA/RNA濃度檢測(cè)、蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)等。

2 微量分光光度計(jì)的校準(zhǔn)方法分析

通過(guò)查閱資料，現(xiàn)有的微量分光光度計(jì)普遍具有的技術(shù)參數(shù)，如表1所示。

與普通的分光光度計(jì)比較，一些基本的技術(shù)參數(shù)還是比較一致的。但是該類儀器預(yù)設(shè)了DNA、RNA、蛋白質(zhì)、熒光染料吸光度值與濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系，所以可以直接給出這些樣品的濃度值。根據(jù)以上技術(shù)參數(shù)及測(cè)試原理，對(duì)微量分光光度計(jì)的校準(zhǔn)就有兩種思路，一是從分光光度計(jì)的原理參照普通分光光度計(jì)的檢定規(guī)程JJG 178-2007《紫外、可見(jiàn)、近紅外分光光度計(jì)》來(lái)校準(zhǔn)，另一種思路是從該類儀器的測(cè)量結(jié)果入手，以濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來(lái)校準(zhǔn)其測(cè)量值的示值誤差等。下面對(duì)兩種思路做分析對(duì)比，并給出合理建議。

表1 微量分光光度計(jì)技術(shù)參數(shù)

2.1 以濾光液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行校準(zhǔn)

該方法可以參照J(rèn)JG 178-2007進(jìn)行部分項(xiàng)目的校準(zhǔn)?？蓪⒉ㄩL(zhǎng)準(zhǔn)確性、波長(zhǎng)重復(fù)性、吸光度準(zhǔn)確性、雜散光等儀器主要關(guān)鍵的技術(shù)指標(biāo)列為校準(zhǔn)項(xiàng)目。對(duì)波長(zhǎng)準(zhǔn)確性和波長(zhǎng)重復(fù)性的校準(zhǔn)可以使用現(xiàn)有的氧化鈥波長(zhǎng)溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，該標(biāo)準(zhǔn)溶液在波長(zhǎng)240～650 nm 范圍有10個(gè)以上尖銳、峰位明確的吸收峰。吸光度的準(zhǔn)確性可以使用JJG 178-2007給出的方法，配制一定濃度的重鉻酸鉀高氯酸溶液或重鉻酸鉀硫酸溶液，用高精度的紫外可見(jiàn)風(fēng)光光度計(jì)定值其在235 nm、257 nm、313 nm、350 nm處的吸光度值。通常是在光程為10 mm定值，使用時(shí)可根據(jù)朗伯比爾定律A=- kLc來(lái)轉(zhuǎn)換更小光程時(shí)的吸光度值，當(dāng)儀器給出的是標(biāo)準(zhǔn)為光程10 mm的吸光值時(shí)則不需要將標(biāo)準(zhǔn)值換算即可進(jìn)行比較。其次要注意校準(zhǔn)時(shí)環(huán)境溫度與定值時(shí)溫度的匹配性。雜散光特性可以根據(jù)JJG 178-2007的要求使用10 g/L的碘化鈉溶液和50 g/L的亞硝酸鈉分別在220 nm和340 nm處檢測(cè)儀器的透光率或吸光度值。以上校準(zhǔn)方式和項(xiàng)目是基于微量分光光度計(jì)的測(cè)量原理，結(jié)合生產(chǎn)商給出的技術(shù)參數(shù)，使用者可以利用校準(zhǔn)結(jié)果對(duì)被校儀器有一個(gè)綜合的評(píng)價(jià)。此外，如果希望進(jìn)一步了解儀器的基線平直度和基線噪聲等指標(biāo)也可參照J(rèn)JG 178-2007來(lái)制定校準(zhǔn)方法。

2.2 以濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行校準(zhǔn)

該方法是在微量分光光度計(jì)可以直接測(cè)定核酸和蛋白質(zhì)類物質(zhì)的含量值基礎(chǔ)上，以DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來(lái)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的測(cè)量值與標(biāo)注值之差作為儀器的示值誤差來(lái)評(píng)價(jià)儀器的計(jì)量特性。該類儀器預(yù)設(shè)了定點(diǎn)波長(zhǎng)測(cè)試功能，并且預(yù)設(shè)了吸光度值與濃度值的關(guān)系。核酸和蛋白質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)260 nm、280 nm，為了判斷核酸或蛋白質(zhì)的純度還增加了A230 nm用來(lái)表示樣品中存在的一些污染物如碳水化合物、苯酚、多肽等，A320 nm用來(lái)表示樣品的渾濁度和其他干擾因子。用濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來(lái)校準(zhǔn)該類儀器還可以將測(cè)量值的重復(fù)性和儀器的線性納入校準(zhǔn)項(xiàng)目，當(dāng)然儀器線性的評(píng)價(jià)需要用到不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3 結(jié)語(yǔ)

綜合上述分析，第一種校準(zhǔn)方式在稍加細(xì)化的基礎(chǔ)上即可以開展校準(zhǔn)工作，且對(duì)于廣大的計(jì)量工作者來(lái)講比較容易上手，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)價(jià)格較低且容易獲得。而后一種校準(zhǔn)方式雖然可以給出微量分光光度計(jì)的測(cè)量結(jié)果的示值誤差、線性等計(jì)量特性優(yōu)劣，但在實(shí)際校準(zhǔn)過(guò)程中如何選定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，僅單一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)還是核酸類和蛋白質(zhì)類共同使用，因?yàn)閮烧呤窃诓煌奈詹ㄩL(zhǎng)下進(jìn)行定量測(cè)量，考查的是不同波長(zhǎng)下濃度測(cè)量的準(zhǔn)確性。而且還需要考慮DNA或RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及蛋白紙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性、經(jīng)濟(jì)性和易獲得性，且對(duì)存儲(chǔ)條件的要求不能太高，尤其是有些DNA含量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的存儲(chǔ)溫度要求較低，不便于計(jì)量工作人員進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)校準(zhǔn)。所以在JJG 178-2007的基礎(chǔ)上研制一套系列標(biāo)準(zhǔn)液，對(duì)該類儀器的波長(zhǎng)準(zhǔn)確性、吸光度準(zhǔn)確性、雜散光等計(jì)量特性進(jìn)行校準(zhǔn)，通過(guò)校準(zhǔn)結(jié)果可以客觀、全面地評(píng)價(jià)儀器的技術(shù)指標(biāo)，給使用者了解該儀器提供更加綜合的數(shù)據(jù)。

[1]全國(guó)物理化學(xué)計(jì)量技術(shù)委員會(huì).JJG 178-2007紫外、可見(jiàn)、近紅外分光光度計(jì)[S].北京：中國(guó)計(jì)量出版社，2007.

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