瓶?jī)?nèi)接種菌根真菌對(duì)毛棉杜鵑生長(zhǎng)與抗性酶的影響

周玉潔，洪文君，黃久香，唐光大

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)南方石灰?guī)r植物研究中心，林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東 廣州 510642)

瓶?jī)?nèi)接種菌根真菌對(duì)毛棉杜鵑生長(zhǎng)與抗性酶的影響

周玉潔，洪文君，黃久香*，唐光大

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)南方石灰?guī)r植物研究中心，林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東 廣州 510642)

【目的】研究毛棉杜鵑(Rhododendronmoulmainense)的接種效應(yīng)，篩選較佳的菌種，為毛棉杜鵑高效育種提供參考，并初步揭示菌根提高植株抗性的機(jī)理?！痉椒ā窟x用7種從野生毛棉杜鵑中分離并鑒定的杜鵑類(lèi)真菌回接到毛棉杜鵑無(wú)菌組培苗中，定期觀察生長(zhǎng)情況，測(cè)定苗高與生物量增長(zhǎng)率、菌根侵染率、病情指數(shù)、PAL酶與LOX酶活性?！窘Y(jié)果】①對(duì)照組2周后枯萎，而接菌組均生長(zhǎng)良好。②7號(hào)菌組苗高生長(zhǎng)率與生物量增重率均為最高，分別為71.81 %與83.62 %，其次是17號(hào)與14號(hào)處理組。③16號(hào)的菌根侵染率最高，1號(hào)菌種最低。7號(hào)的病情指數(shù)最低，5號(hào)、3號(hào)病情指數(shù)最高。各接菌處理組的PAL酶和LOX酶活性均高于CK組，16號(hào)PAL酶、LOX酶活性最高，為4.82與0.88 U/mg，1號(hào)、5號(hào)、17號(hào)PAL酶活性最低，為1.90～2.20 U/mg，1號(hào)、3號(hào)LOX酶活性最低，為0.29～0.38 U/mg。相關(guān)性分析表明，侵染強(qiáng)度與PAL酶活性和LOX酶活性均有顯著正相關(guān)，而病情指數(shù)與侵染強(qiáng)度、PAL酶活性和LOX酶活性均呈負(fù)相關(guān)?！窘Y(jié)論】7種真菌均可與毛棉杜鵑無(wú)菌組培苗形成菌根共生體，但不同菌種對(duì)宿主植物的生長(zhǎng)影響有差異， 7號(hào)(Bionectriaochroleuca)為最優(yōu)的菌種，14號(hào)(Aspergillussydowii)與17號(hào)(Paecilomycesjavanicus)菌種為次優(yōu)菌種。菌根侵染強(qiáng)度越大更加有益于PAL酶和LOX酶的產(chǎn)生，對(duì)植物的抗性與生長(zhǎng)可能有一定程度的影響，但與真菌的種類(lèi)有關(guān)。

毛棉杜鵑；杜鵑類(lèi)真菌；菌根化育苗；生長(zhǎng)效應(yīng)；抗病性；抗逆性

【研究意義】杜鵑類(lèi)菌根(ericoid mycorrhizas，簡(jiǎn)稱(chēng)為ERM)，又被稱(chēng)為歐石楠類(lèi)菌根。特指杜鵑花類(lèi)植物上形成的菌根，屬于一種特殊的內(nèi)生菌根類(lèi)型，對(duì)植株的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，因此常被應(yīng)用于菌根化育苗中[1]。幾乎所有的杜鵑花科植物有明顯的菌根結(jié)構(gòu)，每種杜鵑花科植物的根系均寄生了多種菌種，不同菌種對(duì)植株的影響有所差異[2]。Vohnik M et al.[3]對(duì)Rhododendron‘Azurro’接種ERM菌種后發(fā)現(xiàn)不同菌種、菌種組合對(duì)營(yíng)養(yǎng)吸收、根系生物量等有不同程度的影響，同一菌種的不同菌種的接種效應(yīng)也有一定的差別。有些菌種對(duì)植株傷害較為嚴(yán)重，導(dǎo)致植株病害；而有些菌種對(duì)植株生長(zhǎng)促進(jìn)顯著，或能夠提高植株的抗性能力，表明了優(yōu)良菌種篩選的重要性?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】為篩選出優(yōu)良的菌種，通常先進(jìn)行菌根分離，并運(yùn)用形態(tài)與分子手段鑒定菌種種類(lèi)[4-5]；通過(guò)真菌回接實(shí)驗(yàn)探索各菌種的接種效應(yīng)，從而篩選優(yōu)良菌種[6-7]。歐靜等[8]通過(guò)測(cè)定接種ERM 真菌對(duì)桃葉杜鵑幼苗體內(nèi)的激素含量，表明IAA，GA，ZT，和ZR等激素是促進(jìn)植株生長(zhǎng)的重要原因。杜鵑花類(lèi)植物多分布于較貧瘠的土壤，ERM對(duì)杜鵑植株的抗逆性與逆境環(huán)境的營(yíng)養(yǎng)吸收具有重要的作用[9]。陳可等[10]證明西瓜接種菌根苗能夠激活抗逆性有關(guān)的防御性酶，使根系對(duì)逆境產(chǎn)生快速反應(yīng)，從而提高抗連作障礙的能力?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前針對(duì)菌根與杜鵑類(lèi)植物抗逆性與抗病性的相關(guān)報(bào)道較少。毛棉杜鵑為杜鵑花科杜鵑屬的常綠木本花卉，株形優(yōu)雅，花繁茂而馨香，具有較高的園林應(yīng)用價(jià)值，但由于野生毛棉杜鵑多分布于海拔700～1500 m的山谷[11]，在低海拔地區(qū)生長(zhǎng)易受到限制，高效菌種的篩選有益于毛棉杜鵑的工廠化育苗的實(shí)現(xiàn)。前期研究表明接種菌根有益于提高毛棉杜鵑的抗旱能力[12]，而不同菌種的侵染與相關(guān)抗性酶活性的關(guān)系尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以毛棉杜鵑組培苗為研究對(duì)象，探索菌根對(duì)毛棉杜鵑生長(zhǎng)的影響，篩選出較佳的菌種，為毛棉杜鵑的高效育種提供參考；并進(jìn)一步分析接種真菌后菌根結(jié)構(gòu)對(duì)毛棉杜鵑抗逆性與抗病性相關(guān)酶的影響，以期初步揭示菌根化育苗提高植株抗性的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試毛棉杜鵑為組織培養(yǎng)的無(wú)菌生根苗，苗齡為60 d。菌劑純培養(yǎng)所采用的培養(yǎng)基為MMN培養(yǎng)基[13]。內(nèi)生真菌菌種均從廣東深圳梧桐山毛棉杜鵑野生植株須根中分離獲得。經(jīng)廣東省微生物研究所的形態(tài)與分子測(cè)序鑒定，共有7個(gè)菌種(表1)，均為子囊菌門(mén)，子囊菌類(lèi)Hymenoscyphusericae(Read)Korf &Kernan是最早分離和鑒定的一類(lèi)菌根真菌類(lèi)型。很多杜鵑類(lèi)植物都分離出這種內(nèi)生菌，包括沙龍白珠樹(shù)(Gaultheriashallon)[14]、澳石楠(Epacrisimpressa)[15]、Rhododendronobtusumvar.Kaempferi[16]等。

1.2 菌種的接種

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的組培苗轉(zhuǎn)接于共生培養(yǎng)基中，每瓶接種4株苗，于室溫條件培養(yǎng)15 d后，待接種。接種時(shí)，將5 mm×5 mm左右大小的菌塊，置于裝有生根苗的培養(yǎng)瓶中作為菌源，另將無(wú)菌劑的培養(yǎng)苗作為對(duì)照組。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15瓶，培養(yǎng)光照溫度為25 ℃，光照培養(yǎng)強(qiáng)度2000 lx，光照時(shí)間為12 h/d。培養(yǎng)45 d后，檢測(cè)其菌根侵染率、苗高增長(zhǎng)率、生物量增重率、病情指數(shù)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和脂氧合酶(LOX)活性。

表1 菌種信息

表2 不同菌種對(duì)毛棉杜鵑組培苗生長(zhǎng)形態(tài)比較

1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)

苗高增長(zhǎng)率( %)=接菌苗平均增高/接菌前幼苗平均高度×100 %

生物量增重率( %)=接菌苗平均增重/接菌前幼苗平均干重×100 %

菌根侵染率( %)=被侵染的根段數(shù)/鏡檢的總根段數(shù)×100 %

病情指數(shù)= 100×∑(各級(jí)病葉數(shù)×各級(jí)代表值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級(jí)代表值)

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法

采用SPSS 19.0軟件多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 7種菌種對(duì)毛棉杜鵑幼苗形態(tài)特征的影響

從表2和圖1可知，對(duì)照組幼苗在生長(zhǎng)第8天后老葉開(kāi)始變黃，第15天時(shí)多數(shù)幼苗全株枯萎，可能由于植株在無(wú)菌條件下無(wú)法獨(dú)立在MMN培養(yǎng)基中進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)吸收，導(dǎo)致植株呈現(xiàn)衰亡現(xiàn)象。其他接菌后的植株均表現(xiàn)正常，表明了接種菌種能夠提高植株?duì)I養(yǎng)吸收能力。7種菌種對(duì)毛棉杜鵑幼苗反應(yīng)模式主要呈現(xiàn)為3類(lèi)：①對(duì)根系有促進(jìn)作用，生長(zhǎng)較多的須根，莖部健壯，葉片呈綠色，如7號(hào)、14號(hào)、17號(hào)菌種。②對(duì)根系有促進(jìn)作用，生長(zhǎng)較多的須根，莖部稍顯細(xì)弱，老葉略顯黃色，如3號(hào)、5號(hào)、16號(hào)菌種。③對(duì)根系促進(jìn)不明顯，莖部生長(zhǎng)受到影響，葉片生長(zhǎng)不良，如1號(hào)菌種。

2.2 7種菌種對(duì)毛棉杜鵑幼苗生長(zhǎng)的影響

接菌45 d后，不同菌種組毛棉杜鵑組培苗的苗高增長(zhǎng)率與生物量增重率存在差異(圖2～3)。接種菌種7號(hào)的苗高增長(zhǎng)率最大，為71.81 %，與其他處理組呈顯著差異。其次是菌種17號(hào)、14號(hào)、3號(hào)處理組，苗高增長(zhǎng)率為46.67 %～50.91 %。苗高增長(zhǎng)率較低的為菌種5號(hào)、16號(hào)、1號(hào)與CK處理組，苗高增長(zhǎng)率為32.00 %～35.75 %。其中1號(hào)處理組苗高增長(zhǎng)率低于對(duì)照組，可能由于接種1號(hào)菌種后植株彎曲造成。不同菌種對(duì)毛棉杜鵑組培苗的生物量增重率也存在著差異。接種菌種后的生物量增重率均顯著高于對(duì)照組，接種菌種7號(hào)的生物量增重率最大，為83.62 %。其他的接種菌種處理組增重率為69.27 %～75.24 %。對(duì)照組生物量增重率僅為55.26 %。

圖1 不同菌種對(duì)毛棉杜鵑組培苗生長(zhǎng)形態(tài)比較Fig.1 Comparative study on growth morphology of Rhododendron moulmainense after inoculated by different strains

圖2 接種7種菌種后毛棉杜鵑組培苗各處理組苗高增長(zhǎng)率比較Fig.2 Comparative study on height growth rates of Rhododendron moulmainense after inoculated by different strains

2.3 7種菌種對(duì)毛棉杜鵑幼苗侵染特性與PAL和LOX酶活性的影響

所有菌種在MMN培養(yǎng)基上均能侵染毛棉杜鵑幼苗根系形成菌根，但不同菌種對(duì)毛棉杜鵑幼苗的侵染率存在顯著差異(表3)。菌種16號(hào)的菌根侵染率最高，高達(dá)95.5 %，其次是菌種3、7、14號(hào)，侵染率為81.82 %～88.00 %，均顯著高于其他菌種。1、5、17號(hào)侵染率最低，為60.00 %～70.00 %。病情指數(shù)是全面考慮發(fā)病率與嚴(yán)重度的綜合指標(biāo)，不同菌種對(duì)毛棉杜鵑幼苗產(chǎn)生一定傷害作用。菌種7號(hào)的病情指數(shù)最低，與其他處理組呈顯著差異，其次是16、14、1、17號(hào)，病情指數(shù)介于37.50 %～47.50 %，接種菌種處理中病情指數(shù)較高的為5、3號(hào)，表明不同菌種對(duì)植株傷害作用各不相同，但各接菌處理組的病情指數(shù)均低于CK組，可能由于CK組缺乏營(yíng)養(yǎng)而導(dǎo)致植物病態(tài)較為嚴(yán)重。苯丙氨酸解氨酶(PAL)是植物苯丙烷途徑的關(guān)鍵酶和限速酶，與植物的抗逆境能力有著重要的關(guān)系。脂氧合酶(LOX)是植物合成愈創(chuàng)激素、愈創(chuàng)酸和茉莉酮酸等產(chǎn)物的限速酶，與植物的抗病性直接相關(guān)。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同菌種對(duì)毛棉杜鵑幼苗PAL酶與LOX酶活性存在差異，各菌種的PAL酶和LOX酶活性均高于CK組(表3)，表明菌根侵染誘導(dǎo)了PAL酶和LOX酶的產(chǎn)生。菌種侵染組中，16號(hào)PAL酶活性最高，為4.82 U/mg，其次是3、7、14號(hào)，為3.32～3.97 U/mg，PAL酶活性最低的為1、5、17號(hào)，為1.90～2.20 U/mg，16號(hào)LOX酶活性最高，為0.88 U/mg，其次是5、7、14、17號(hào)，為0.53～0.61 U/mg，LOX酶活性最低的為1、3號(hào)，為0.29～0.38 U/mg。從相關(guān)性分析看(表4)，侵染強(qiáng)度與PAL酶活性和LOX酶活性均有較為顯著的正相關(guān)性，而病情指數(shù)與侵染強(qiáng)度、PAL酶活性和LOX酶活性均呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明了侵染的越強(qiáng)，對(duì)PAL酶與LOX酶活性生成起到促進(jìn)作用，PAL酶與LOX酶活性升高，可能會(huì)一定程度上減少植株的病情指數(shù)，但并不是PAL酶與LOX酶活性越高，病情指數(shù)就越高，因此病情指數(shù)與真菌種類(lèi)也有一定關(guān)系。

圖3 接種7種菌種后毛棉杜鵑組培苗各處理組生物量增重率比較Fig.3 Comparative study on biomass growth rate of Rhododendron moulmainense after inoculated by different strains

表3 不同菌種對(duì)毛棉杜鵑組培苗侵染特性與PAL和LOX酶活性的比較

表4 不同菌種對(duì)毛棉杜鵑幼苗侵染特性指標(biāo)相關(guān)性分析

注：* 在置信度(雙測(cè))為 0.05 時(shí)，相關(guān)性是顯著的。

3 討 論

3.1 不同菌種對(duì)毛棉杜鵑生長(zhǎng)的影響

近年來(lái)組培技術(shù)得到推廣應(yīng)用，但蘭科、杜鵑花類(lèi)等菌根類(lèi)植物組培苗在無(wú)菌條件下繁殖，缺少菌根真菌侵染導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢且質(zhì)地細(xì)弱，移栽到田間后對(duì)自然環(huán)境適應(yīng)力差，雖然在自然界中雖然能感染菌根真菌，但延長(zhǎng)了緩苗期，且增加了死亡率[17]。因此，本研究在已有的組培技術(shù)上進(jìn)行了瓶?jī)?nèi)接菌實(shí)驗(yàn)，以提高后期出苗成活率。試驗(yàn)結(jié)果表明，7個(gè)菌種對(duì)植株生長(zhǎng)影響各有差異，Bionectriaochroleuca(7號(hào))、Aspergillussydowii(14號(hào))和Paecilomycesjavanicus(17號(hào))菌種對(duì)毛棉杜鵑幼苗促生作用較好，可作為毛棉杜鵑組培苗的高效菌種。菌根結(jié)構(gòu)有助于提高植株?duì)I養(yǎng)吸收能力，使植株能在逆境中生長(zhǎng)。本研究結(jié)果表明，未接菌的對(duì)照組在不適宜生長(zhǎng)的MMN培養(yǎng)基上無(wú)法正常生長(zhǎng)，而接菌組均能生長(zhǎng)良好?？赡苡捎贛MN培養(yǎng)基成分中的營(yíng)養(yǎng)成分難以被植株直接吸收應(yīng)用，接種菌根有益于難分解的營(yíng)養(yǎng)成分被植株吸收應(yīng)用[18]，不同菌根對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的利用率不同，有些杜鵑類(lèi)菌根對(duì)無(wú)機(jī)氮的吸收率高，而有些對(duì)有機(jī)氮吸收率高[19]，且不同菌種對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的吸收不同[20]，因此本研究中各植株呈現(xiàn)不同的生長(zhǎng)情況。

3.2 不同菌種對(duì)毛棉杜鵑抗性影響

菌根結(jié)構(gòu)能夠提高植物的抗性酶活，從而提高植物的抗性能力[21]。研究[22-23]表明病蟲(chóng)感染，機(jī)械損傷等脅迫均能使植株的相關(guān)抗性酶增加[24]。本研究中菌根侵染與植物的抗病性與抗逆性酶活性具有顯著的相關(guān)性，與梁軍等[25]以楊樹(shù)為研究材料接種菌根后菌根侵染率與抗性酶活性的變化性相似。由此推測(cè)菌根侵染過(guò)程中真菌對(duì)根系的機(jī)械損傷可能會(huì)使植株的抗性酶增加。杜鵑科植物中，黃酮類(lèi)的積累是植株葉片呈現(xiàn)紅色的重要次生物質(zhì)[26]，而苯丙氨酸正是調(diào)控黃酮類(lèi)化合物的重要酶[27]，因此本研究中PAL酶活性較高的7號(hào)與16號(hào)菌種處理組植株莖或葉出現(xiàn)明顯的紅色。不同菌種對(duì)植株的抗病性影響有所差異，雖與菌根侵染植株后植株產(chǎn)生的脂氧合酶有一定的關(guān)系，脂氧合酶在菌根真菌的影響下能夠提高植株的抗病力[28-29]，但真菌本身對(duì)植株的抗病能力影響較大。本研究中接種Bionectriaochroleuca菌組病情指數(shù)最低，此前在多種植物中均分離出此種菌種，此種菌所產(chǎn)生的抗生素類(lèi)物質(zhì)可以對(duì)某些病原菌起特異性拮抗作用，因此對(duì)枯萎病、赤霉病等有防御作用[30-31]，因此，雖然7號(hào)菌處理組LOX酶活性低于16號(hào)，但卻表現(xiàn)出較低的病情指數(shù)。

4 結(jié) 論

結(jié)果證實(shí)7個(gè)從毛棉杜鵑野生植物中分離的菌種均可與毛棉杜鵑形成菌根共生體，但不同菌種與宿主植物的親和力存在顯著差異，反映了不同的菌根真菌對(duì)毛棉杜鵑植物生長(zhǎng)的有益性存在差異及高效菌種篩選的必要性。本次試驗(yàn)菌種中7號(hào)(Bionectriaochroleuca)為最優(yōu)的菌種，14號(hào)(Aspergillussydowii)與17號(hào)(Paecilomycesjavanicus)菌種為次優(yōu)菌種。菌根侵染有益于PAL酶和LOX酶的產(chǎn)生，對(duì)植物的抗性與生長(zhǎng)可能有一定程度的影響，但與真菌的種類(lèi)有關(guān)。

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ImpactofInoculationwithMycorrhizalFungiinvitroonGrowthandResistantEnzymesofRhododendronmoulmainense

ZHOU Yu-jie, HONG Wen-jun, HUANG Jiu-xiang, TANG Guang-da

(South China Limestone Plants Research Center, College of Forestry and Landscape Architecture, South China Agricultural University, Guangdong Guangzhou 510642, China)

【Objective】The study ofRhododendronmoulmainenseinoculation with mycorrhizal fungi was conducted to select the better strains, and to provide the reference for improving breeding efficiency, also to reveal the mechanism of improving plant resistance by mycorrhizal fungi. 【Method】7 kinds ericoid mycorrhizal fungis, separated from wildRhododendronmoulmainense, were used to inoculateRhododendronmoulmainensetissue culture seedling. Growth situation was observed regularly, and height growth rate, biomass growth rate, mycorrhizal infection rate, disease index, PAL and LOX activity were determined.【Result】(i) Plants of control group were wizened after 2 weeks, but plants of mycorrhizal inoculation treatment were viable.(ii) Height growth rates and biomass growth rates of No.7 treatment were the highest, 71.81 % and 83.62 % respectively, No.17 and No.14 treatment fllowed. Mycorrhizal infection rates of No.16 treatment were the highest, No.1 treatment were the lowest. Disease indexes of No.7 were the lowest, No.5 and No.3 were the highest. PAL and LOX activity of each mycorrhizal inoculation treatment all higher than control group. PAL and LOX activity of No.16 treatment were the highest, 4.82 and 0.88 U/mg respectively, PAL activity of No.1, No.5, No.17 were the lowest, 1.90-2.20 U/mg, LOX activity of No.1, No.3 were the lowest, 0.29-0.38 U/mg. The correlation analysis showed that, colonization intensity were positively correlated with PAL and LOX activity significantly, but disease index were negatively correlated with PAL and LOX activity. 【Conclusion】Each of the 7 kinds ericoid mycorrhizal fungi could form mycorrhizal symbionts withRhododendronmoulmainense, but different fungis had different impact on growth of host plants, the result showed that, No.7(Bionectriaochroleuca) was the optimal fungi, No.14(Aspergillussydowii)and No.17(Paecilomycesjavanicus) were the second choices. Higher mycorrhizal infection rate helped to improve PAL and LOX activity. It may have an impact on resistant and growth of plants, but resistant and growth of plants were more impacted by species of fungi.

Rhododendronmoulmainense; Ericoid mycorrhizal fungi; Seedling of mycorrhizal fungi; Growth effect; Disease resistance; Stress resistance

1001-4829(2017)12-2687-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.12.012

2017-02-17

廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(11C12100776/L1110887)

周玉潔(1992-)，女，重慶人，碩士研究生，主要從事園林植物運(yùn)用研究；*為通訊作者：黃久香(1975-)，女，副教授，E-mail：137877360@qq.com。

S685.21

A

(責(zé)任編輯李 潔)