肺結核病蛋白質標志物篩選及臨床價值研究

牟寶華 施力穎 尉理梁 王沖 江婷婷?

·臨床研究·

肺結核病蛋白質標志物篩選及臨床價值研究

牟寶華 施力穎 尉理梁 王沖 江婷婷?

目的 探討肺結核病蛋白質標志物的篩選方法。方法 利用酶聯免疫吸附法篩選肺結核病的治愈標志物。結果 α-1抗胰糜蛋白酶（AACT）、叢生蛋白（CLU）、免疫球蛋白α-1鏈C區(qū)（IGHA1）3個蛋白質在治愈肺結核病患者中均較未用藥組顯著降低，并且由這3個蛋白質構建的判定模型的敏感度達79.59%，特異度達77.36%。結論 AACT、CLU、IGHA1有可能成為治愈肺結核病的血清標志物。

肺結核病 酶聯免疫吸附法 治愈 標志物

Objective To explore the scanning of tuberculosis biomarkers. Methods The enzyme-linked immunosorbent assays aimed on proteins related with the inf l ammatory state were performed. Result Alpha-1-antichymotrypsin（AACT），clusterin（CLU），and Ig alpha-1 chain C region（IGHA1）showed signif i cantly reduced levels in cured pulmonary tuberculosis（TB）patients than untreated ones. Furthermore，the decision model established by these three proteins reached a sensitivity of 79.59%，and a specif i city of 77.36%. Conclusion It is suggested that AACT，CLU，IGHA1 may be served as potential biomarkers for curing TB.

Pulmonary tuberculosis ELISA Cured Biomarkers

據WHO報道［1］，2015年全球肺結核新發(fā)病例1040萬。中國第五次結核病流行病學調查［2］，＞15歲活動性肺結核患者499萬，肺結核仍是中國傳染性疾病的重要防治對象。肺結核的治療一直沿用WHO的督導化療方案［3］。痰培養(yǎng)是用于鑒別治療結果最常用檢查手段，但有培養(yǎng)時間長、分辨功效差的缺點［4］。因此亟需發(fā)現一種非培養(yǎng)、高效、定量的衡量治療效果的新方法［5］。研究表明，α-1抗胰糜蛋白酶（AACT）、叢生蛋白（CLU）、免疫球蛋白α-1鏈C區(qū)（IGHA1）均與機體炎癥狀態(tài)相關，且被發(fā)現在初診肺結核病患者中顯著改變［6］。本文探討肺結核病蛋白質標志物的篩選方法。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選擇 2013年6月至2016年5月紹興市中心醫(yī)院和紹興市立醫(yī)院肺結核病患者181例，男101例，女80例；年齡21～56歲。排除肺外結核、惡性腫瘤、慢性疾病、自身免疫性疾病和HIV感染患者?？菇Y核治療按照DOTS標準進行，同時采取隨訪制度，其中未用藥63例、用藥2個月57例和治愈61例，三組患者年齡、性別、體重指數等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（見表1）。本項目經倫理委員會批準，患者均知情并簽署同意書。

表1 肺結核病患者基本資料（x±s）

1.2 方法 （1）儀器與試劑：Bio-Rad Xmark微孔板分光光度計；華利達恒溫恒濕箱。人AACT（試劑盒ELISA Kit， 檢測 范 圍 ：0.312～20mg/L，P01011）、人CLU（試劑盒 ELISA Kit，檢測范圍 ：3.12～200μg/L，P10909）和人IGHA1（試劑盒 ELISA Kit，檢測范圍：0.49～2000μg/L，P01876）購自武漢華美生物工程有限公司。（2）樣本采集：所有受試者均晨起空腹抽血，取外周血5.0ml于不抗凝真空采血管中，4h內于4℃、3000r/min離心10min，取上層血清液，血清分裝后保存于-80℃?zhèn)溆?。?）酶聯免疫吸附實驗（ELISA）：按說明書要求，按一定比例稀釋血清樣本：人AACT試劑盒血清稀釋比例為1：400，人CLU試劑盒血清稀釋比例為1：10000，人IGHA1試劑盒血清稀釋比例為1：16000。按試劑說明書操作使用，Xmark微孔板分光光度計在450nm波長下讀取吸光度，并估計蛋白濃度。1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0和GraphPad Prism 5軟件。計量資料以（x±s）表示，用Mann-Whitney U檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組患者各檢測指標比較 本實驗共納入未用藥肺結核病患者63例，用藥2個月肺結核患者57例，治愈肺結核患者61例?；颊吲R床檢查結果統(tǒng)計分析發(fā)現：白蛋白、球蛋白、白球比、乳酸脫氫酶、葡萄糖和免疫球蛋白A在治愈組較未用藥組有顯著差異（P＜0.05），且總蛋白、白蛋白、載脂蛋白A1、C反應蛋白、補體C4在用藥2個月組和未用藥組亦存在顯著差異（P＜0.05）見表2。

表2 三組患者各檢測指標比較（x±s）

2.2 ELISA結果分析 通過對三組患者血清進行3個時間點的ELISA檢測，發(fā)現血清AACT、CLU、IGHA1蛋白質的表達水平差異有統(tǒng)計學意義（P=0.043，P=0.026，P＜0.001）， 且 存 在 線 性 趨勢（P=0.015，P=0.013，P＜0.001）。 其 中，AACT、CLU、IGHA1三個蛋白質在治愈肺結核病患者中均較未用藥組顯著降低（分別為［（1236.66±890.80）μg/ml vs （1948.24±1484.23）μg/ml，P=0.010］；［（103.55±33.07）μg/ml vs （125.34±59.77）μg/ml，P=0.021］；［（688.73±324.07）μg/ml vs （1346.44±783.93）μg/ml，P＜0.001］。 另外，IGHA1在 用 藥2個月組即顯著下降［（1111.98±732.53）μg/ml vs（1346.44±783.93）μg/ml，P=0.039］（ 見圖 1）。

圖1 肺結核病患者用藥前后血清蛋白質水平改變

2.3 邏輯回歸模型的建立與分析 繪制ROC曲線，發(fā)現AACT、CLU、IGHA1三個蛋白質的曲線下面積分別為0.617、0.574和0.816。通過邏輯回歸分析，用這3個蛋白質構建回歸方程：Logit（p）=4.3584-0.0003916*（AACT）-0.008404*（CLU）-0.003114*（IGHA1）。該模型的靈敏性和特異性均較單一蛋白質升高，敏感度為79.59%，特異度為77.36%，曲線下面積為 0.841（見圖 2）。

圖2 判定肺結核病是否治愈的邏輯回歸模型

3 討論

浙江省肺結核病治愈率低下約83.2%，其中新涂陽率86.0%，低于全國平均水平（92.0%），患者療程末期痰涂片檢查與否是影響治愈率的首要因素，痰涂片檢查陽性率低進一步影響患者的治愈率。因此，尋找快速、準確的肺結核病療效評價標志物具有重要意義。

回顧性研究［7］發(fā)現，高敏C反應蛋白（hs-CRP），和降鈣素原在肺結核病患者體內升高，并在抗結核治療后顯著下降。高智等［8］也發(fā)現肺結核病患者強化期治療后IL-2、SIL-2R顯著升高，IL-4顯著下降。多項研究表明，抗結核治療后肺結核病患者血清小分子水平有所改變，可以作為肺結核病治愈的指標。也有研究［9］指出肺結核病患者肝臟功能受損，白蛋白減少；免疫系統(tǒng)激活，球蛋白增加；補體系統(tǒng)激活。本資料顯示，抗結核治療后肺結核病患者向健康轉歸，相應臨床檢測指標恢復正常水平。另外，宋仕玲等研究［10］認為肺結核病患者多種血清免疫球蛋白、補體蛋白在抗結核治療后明顯好轉。而本資料顯示免疫球蛋白A顯著改變，這可能是由于樣本數更大，修正了前人研究的抽樣誤差。

AACT是一種急性反應期蛋白，在炎癥狀態(tài)下升高；同時，也是一種血清抑制因子，可抑制蛋白酶活性。有研究表明，AACT蛋白質在未用藥的肺結核病患者中顯著升高［6］。而在本實驗中，在治愈后的肺結核病患者中，AACT含量顯著下降。這表明，肺結核病患者的炎癥狀態(tài)在治愈后得到改善。AACT還是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑的成員，能調節(jié)中性粒細胞組織蛋白酶G的活性，中性粒細胞組織蛋白酶G是一種蛋白水解酶可導致血管基質降解和凝血障礙，肺結核病患者血液呈高凝血狀態(tài)。因此，作者認為AACT蛋白可能也與患者凝血狀態(tài)相關，表明治愈后患者高凝血狀態(tài)恢復。

CLU（又稱為載脂蛋白J），是一種75～78kDa的分泌異質二聚體的糖蛋白，其能激活小膠質細胞，引發(fā)炎癥級聯反應，與多種炎性疾病相關。同時，CLU蛋白是一種細胞外分子伴侶，具有可溶性先天免疫受體特性，能調節(jié)巨噬細胞吞噬作用［11］，并在細胞粘附和補體系統(tǒng)中起到重要作用［12］。有研究發(fā)現，CLU在肺結核病患者中顯著升高［6］，而本資料結果顯示，治愈的肺結核病患者血清CLU蛋白表達水平顯著下降。這表明，治愈后肺結核病患者的炎癥和免疫狀態(tài)得以恢復。

免疫球蛋白A（IgA）是黏膜部位的最常見抗體，在抵抗病原菌入侵過程中具有重要作用，是引發(fā)促炎細胞過程的有效刺激。IgA通過其Fc受體與中性粒細胞上的IgA Fc受體（FcαRI）可促發(fā)炎癥反應過程，FcαRI是IgA抗炎和促炎反應的調節(jié)劑［13］。本資料結果顯示IgA在治愈肺結核病患者中下降。ELISA驗證結果顯示，治愈后的肺結核病患者IGHA1（IgA Fc片段）含量顯著下降，且其在2個月強化期治療結束時就已經顯著低于未用藥組。因此，作者推測IGHA1含量的降低可能與肺結核病患者治療后的炎癥反應恢復相關，可能具有預測抗結核治療功效的作用。

通過邏輯回歸分析將AACT、CLU、IGHA1三個蛋白質組成蛋白質模型，并獲得診斷方程式，發(fā)現該模型對治愈的肺結核病具有良好的診斷價值。因此，作者認為AACT、CLU、IGHA1三個蛋白質可作為治愈肺結核病的血清標志物。

［1］ World Health Organization. Global Tuberculosis Report,2016.

［2］ 王黎霞,成詩明,陳明亭,等. 2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查報告. 中國防癆雜志,2012,34(8)：485-508.

［3］ World Health Organization. Treatment of tuberculosis - guidelines,4th ed. Geneva［DB/OL］.

［4］ Nahid P,Saukkonen J,Kenzie WRM,et al. Tuberculosis Biomarker and Surrogate Endpoint Research Roadmap. American Journal of Respiratory & Critical Care Medicine,2011,184(8)：972-979.

［5］ Phillips PP,Fielding K,Nunn AJ. An Evaluation of Culture Results during Treatment for Tuberculosis as Surrogate Endpoints for Treatment Failure and Relapse. Plos One,2013,8(5)：926-930.

［6］ Tanaka T,Sakurada S,Kano K,et al. Identification of tuberculosisassociated proteins in whole blood supernatant. Bmc Infectious Diseases,2011,11(12)：1-10.

［7］ 羅曉璐,劉澤端,蘇國生,等.超敏C反應蛋白和降鈣素原檢測在結核病診斷中的臨床價值. 慢性病學雜志,2014,15(4)：277-279.

［8］ 高智,蔣之,萬軻.初治肺結核患者強化治療前后檢測IL-2、SIL-2R及IL-4的臨床意義. 安徽醫(yī)藥,2012,16：215-216.

［9］ Wang C,Li Y Y,Li X,et al. Serum complement C4b,fibronectin,and prolidase are associated with the pathological changes of pulmonary tuberculosis. BMC Infectious Diseases,2014,31(14)：52.

［10］ 宋仕玲,朱艷,黃團新.卡介菌多糖核酸注射液對部隊肺結核患者免疫球蛋白和C3、C4的影響. 武警醫(yī)學,2008,19：707-709.

［11］ Cunin P, Beauvillain C, Miot C, et al. Clusterin facilitates apoptotic cell clearance and prevents apoptotic cell-induced autoimmune responses. Cell Death Dis,2016,7：e2215.

［12］ Koltai T. Clusterin： a key player in cancer chemoresistance and its inhibition. Oncotargets & Therapy,2014,7(2)：447-456.

［13］ Aleyd E, Heineke MH, Van Egmond M. The era of the immunoglobulin A Fc receptor FcαRI,its function and potential as target in disease. Immunol Rev,2015,268(1)：123-138.

國家重點基礎研究發(fā)展計劃（2014CB543002）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生一般研究計劃（2014KYB288）

312000 浙江省紹興市中心醫(yī)院（牟寶華）

316000 浙江醫(yī)院（施力穎）

312000 浙江省紹興市立醫(yī)院（尉理梁）

316000 杭州市婦女保健院（王沖）

510006 華南理工大學醫(yī)學院（江婷婷）

*通信作者