蜀柏毒蛾性信息素及其林間誘集效果初步研究

周建華，韋 衛(wèi)，趙莉藺，肖銀波，范成治，賈玉珍，馬 娟

(1. 四川省林業(yè)科學(xué)研究院，成都 610081；2.中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所，農(nóng)業(yè)蟲(chóng)鼠害綜合治理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100080；3.閬中市林業(yè)局，閬中 637400)

蜀柏毒蛾性信息素及其林間誘集效果初步研究

周建華1，韋 衛(wèi)2，趙莉藺2，肖銀波1，范成治1，賈玉珍1，馬 娟3

(1. 四川省林業(yè)科學(xué)研究院，成都 610081；2.中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所，農(nóng)業(yè)蟲(chóng)鼠害綜合治理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100080；3.閬中市林業(yè)局，閬中 637400)

采取正己烷溶劑浸提法提取蜀柏毒蛾處女雌蛾性信息素腺體中的性信息素，運(yùn)用氣相色譜-觸角電位聯(lián)用儀(Gas Chromatography-electroantennographic Detection, GC-EAD) 測(cè)定蜀柏毒蛾雄蛾觸角對(duì)雌蛾性信息素腺體提取物中性信息素成分的活性反應(yīng)，并運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Gas Chromatograph-Mass Spectrum, GC-MS)鑒定其活性反應(yīng)成分。GC-EAD結(jié)果顯示雄蛾觸角對(duì)雌蛾性信息素腺體提取物中的2種成分有較好的反應(yīng)。GC-MS分析結(jié)果表明能引起雄蛾觸角電生理反應(yīng)的成分為順-9-十八碳烯醛和順-9-十八碳烯醇。林間試驗(yàn)表明，順-9-十八碳烯醛和順-9-十八碳烯醇誘芯對(duì)蜀柏毒蛾有相近的誘集效果，表明順-9-十八碳烯醛和順-9-十八碳烯醇是蜀柏毒蛾性信息素主要成份。通過(guò)對(duì)復(fù)合組分配方順-9-十八碳烯醛∶順-9-十八碳烯醇=1∶9(200 μg)、順-9-十八碳烯醛∶順-9-十八碳烯醇=9∶1(200 μg)和單組分配方順-9-十八碳烯醛(200 μg)、順-9-十八碳烯醇((200 μg)4種配方誘芯林間誘集效果試驗(yàn)，結(jié)果4種配方均具有一定的誘集效果，但復(fù)合組分誘集效果比單組分誘集效果好。

蜀柏毒蛾；性信息素；成分鑒定；林間誘集

蜀柏毒蛾(ParocneriaorientaChao )是四川省第一大林業(yè)有害生物，每年發(fā)生面積達(dá)33萬(wàn)hm2,給林業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失[1]。目前，該害蟲(chóng)的監(jiān)測(cè)主要采用林間樣線和樣地的人工調(diào)查。由于該害蟲(chóng)空間分布的特殊性，加之人工調(diào)查受時(shí)間和人力限制，造成林間調(diào)查的準(zhǔn)確性和時(shí)效性較差[2]。

采用昆蟲(chóng)性信息素對(duì)目標(biāo)害蟲(chóng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)預(yù)警，已在國(guó)內(nèi)外得到廣泛研究與應(yīng)用[3]。目前對(duì)蜀柏毒蛾的研究主要在其生物學(xué)、生態(tài)學(xué)特性和化學(xué)生物防治技術(shù)方面，對(duì)其性信息素成分及其林間應(yīng)用的研究還未見(jiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟲(chóng)源

實(shí)驗(yàn)所用蜀柏毒蛾采自于德陽(yáng)市旌陽(yáng)區(qū)新中基鎮(zhèn)。2010年5月上旬在當(dāng)?shù)匕貥?shù)林樹(shù)冠上采蛹，將蛹單獨(dú)存放于裝有濕土的玻璃管(高8 cm,內(nèi)徑2.3 cm)內(nèi)，用紗布封口。將玻璃瓶帶回室內(nèi)逐日檢查羽化情況，室內(nèi)溫度28±3℃，相對(duì)濕度60%±5%。待蛹羽化分雌雄后，雌雄分別置于養(yǎng)蟲(chóng)籠(長(zhǎng)40 cm，寬40 cm,高50 cm)中，用8 cm直徑的培養(yǎng)皿供10%的蜂蜜水，并給予自然光周期，雄蛾待用于GC-EAD分析，處女雌蛾待用作提取性信息素。

1.1.2 主要儀器

美國(guó)Agilent Technologies公司HP6890N/5973N氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)；美國(guó)Agilent Technologies 7890A氣相色譜儀-荷蘭Syntech觸角電位聯(lián)用儀(GC-EAD)。

1. 2 雌蛾性信息素粗提物提取時(shí)間

將裝有羽化的蜀柏毒蛾處女雌蛾的養(yǎng)蟲(chóng)籠放置實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)觀察雌蛾在羽化后第1天凌晨進(jìn)入求偶期，通過(guò)羽化1 d～3 d的觀察，每天5 h～8 h為求偶高峰，此時(shí)雌蛾性信息素腺體部分外伸，周?chē)鄱暾癯嵊w相當(dāng)活躍，與報(bào)道的蜀柏毒蛾處女雌蛾的性信息素產(chǎn)生和釋放節(jié)律相近[4]，此時(shí)為雌蛾性信息素提取最佳時(shí)間。

1.3 雌蛾性信息素粗提物的提取

實(shí)驗(yàn)采取溶劑浸提法，所用溶劑為質(zhì)譜分析純正己烷。羽化后第2天～第3 天 5∶00至7∶50時(shí)間段共采集處于求偶期的處女雌蛾36頭，待其性信息素腺體外伸時(shí)用手輕輕擠壓雌蛾腹部，迫使其完全伸出性信息素腺體，用手術(shù)剪剪下腺體，將腺體放入預(yù)先裝有1.5 mL質(zhì)譜分析純正己烷的樣品瓶(內(nèi)徑0.5 cm,高3.2 cm)內(nèi)，室溫下靜止浸提30 min后將腺體取出。36頭雌蛾性信息素腺體浸提結(jié)束后，將浸提液用無(wú)水硫酸鈉干燥過(guò)濾,然后用氮?dú)鉂饪s至0.036 mL,用瓶塞密封后置入冰箱中低溫(-6℃)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 雌蛾性信息素提取物的GC-EAD分析

將羽化后第2 d～第3 d的蜀柏毒蛾雄蛾觸角用解剖剪剪下，將觸角頂端剪除約0.5 mm，處理后觸角長(zhǎng)度約6 mm，用導(dǎo)電硅膠將觸角與EAG探頭(PRG-2)叉狀觸角固定器的兩個(gè)銀電極聯(lián)接，然后將電極插入EAG探頭中。分離毛細(xì)柱為DB-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm，J&W Scientice, Folsom, CA)，出口端接分流器(OSS-2, SGE, 澳大利亞)，分流比1∶2，分流的化合物一部分導(dǎo)入FID氫火焰離子檢測(cè)器，另一部分經(jīng)過(guò)加熱套吹向觸角，用GC-EAD軟件 (Syntech, The Netherlands) 同步記錄氣相色譜和觸角電位圖。

氣相色譜檢測(cè)器為FID氫火焰離子檢測(cè)器，載氣為氮?dú)?，無(wú)分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量2 μL。升溫程序?yàn)椋浩鹗紲囟?0 ℃，保持2 min，以5 ℃·min-1的速率程序升溫至280 ℃，保持2 min，最后以10 ℃·min-1升溫至320 ℃，保持5 min。進(jìn)樣口溫度220 ℃，檢測(cè)器溫度280 ℃。記錄到的信號(hào)經(jīng)放大器(UN-06,Syntech)連接到IDAC轉(zhuǎn)換器(Auto Spike, IDAC2/3, Syntech),再接到計(jì)算機(jī)的硬件采集卡上，通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件(EAD版本2.3, Syntech)采集和分析數(shù)據(jù)。至少記錄到8頭蜀柏毒蛾雄蛾觸角在同一保留時(shí)間對(duì)處女雌蛾性信息素腺體提取物的反應(yīng)。

1.5 雌蛾性信息素成分的GC-MS分析

蜀柏毒蛾處女雌蛾性信息素腺體提取物(36個(gè)雌蟲(chóng)當(dāng)量，36FE)的組分鑒定在Agilent 6890N-5937N GC/MS上進(jìn)行，色譜柱為DB-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm，J&W Scientice, Folsom, CA), 進(jìn)樣量2 μL,無(wú)分流進(jìn)樣。升溫程序?yàn)槠鹗紲囟?0 ℃，保持2 min，以5 ℃·min-1的速率程序升溫至280℃，保持2 min，最后以10 ℃·min-1升溫至320 ℃。電離方式EI，電離能量為70 eV，離子源發(fā)生器溫度為250 ℃，質(zhì)量掃描范圍為30 amu～500 amu?；钚猿煞值蔫b定是通過(guò)GC-MS總離子流色譜圖與GC-EAD圖譜比較之后，根據(jù)聯(lián)機(jī)的Nist02數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并結(jié)合質(zhì)譜圖中分子離子峰和碎片離子峰來(lái)定性。

1.6 性信息素誘芯誘集試驗(yàn)

1.6.1 性信息素誘芯的配制

順-9-十八碳烯醛(中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物所提供)、順-9-十八碳烯醇(中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物所提供)分別按以下4種比例:順-9-十八碳烯醛∶順-9-十八碳烯醇=1∶9(200μg)、順-9-十八碳烯醛∶順-9-十八碳烯醇=9∶1(200μg)、順-9-十八碳烯醛(200μg)和順-9-十八碳烯醇(200μg)，分別加入100 ml分析純石油醚為溶劑配制成的4種配方溶液，利用硅橡膠塞誘芯(昆蟲(chóng)性信息素誘芯專(zhuān)用型)作為性信息素成份載體,將上述4種配方溶液,用注射器將溶液注入橡膠塞的凹處,每個(gè)橡膠塞注入量2 ml ,待溶劑揮發(fā)后,即配制成了4種蜀柏毒蛾性信息素誘芯密封低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 性信息素誘芯林間誘集試驗(yàn)

用塑料瓦棱板制成三棱柱形誘捕器，誘捕器截面19 cm×19 cm×21 cm,棱長(zhǎng)25 cm,將一涂有粘蟲(chóng)膠的蠟紙板21 cm×25 cm插入誘捕器內(nèi)使其位于底部,用大頭針將誘芯釘在膠版中央。

5月，在蜀柏毒蛾羽化期，在德陽(yáng)市旌陽(yáng)區(qū)新中基鎮(zhèn)選擇蜀柏毒蛾發(fā)生危害重實(shí)驗(yàn)林13.33 hm2左右，進(jìn)行低溫保存?zhèn)溆?種不同配方的蜀柏毒蛾性信息素誘芯及空白對(duì)照誘集效果試驗(yàn)。

每種配方誘芯的誘捕器放置數(shù)量為30個(gè)(重復(fù)3次，每組10個(gè))，誘捕器之間的距離為10 m，懸掛高度為1 m，誘捕器之間隨機(jī)排列。從7∶00開(kāi)始誘集，每24hr對(duì)誘捕器內(nèi)誘到的成蟲(chóng)數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，誘集時(shí)間為5d，誘集結(jié)束時(shí)對(duì)誘捕器上的蜀柏毒蛾成蟲(chóng)進(jìn)行識(shí)別計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 DPS 7.05 軟件進(jìn)行方差分析，用Duncan 氏新復(fù)極差法比較差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜀柏毒蛾性信息素成分GC-EAD和GC-MS分析結(jié)果

用GC-MS分析蜀柏毒蛾處女雌蛾性信息素腺體提取物(36FE)，發(fā)現(xiàn)提取物中含有較多的雜質(zhì)，其中多為長(zhǎng)鏈烷烴和油酸類(lèi)。

由GC-EAD圖譜(圖1)可知在保留時(shí)間33.68 min(A氣譜峰)和34.43 min(B氣譜峰)時(shí)，存在著能引起蜀柏毒蛾雄蛾觸角電生理反應(yīng)的活性物質(zhì)。按照GC-EAD測(cè)試中同樣的毛細(xì)管氣相色譜分析條件對(duì)蜀柏毒蛾處女雌蛾性信息素腺體提取物進(jìn)行了GC-MS分析，得到提取物的總離子流色譜圖(圖2)。

圖1 蜀柏毒蛾雄蛾觸角對(duì)處女雌蛾性信息素腺體提取物的GC-EAD反應(yīng)Fig.1 GC-EAD responses of Parocneria orienta male antennae to sex pheromone gland extracts from virgin females

圖2 蜀柏毒蛾處女雌蛾性信息素腺體提取物的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of sex pheromone gland extracts from virgin females of Parocneria orienta

用GC-EAD的GC圖譜與GC-MS總離子流色譜圖進(jìn)行對(duì)比，GC-EAD的GC圖譜A氣譜峰對(duì)應(yīng)的GC-MS分析給出蜀柏毒蛾性信息素化學(xué)成分為順-9-十八碳烯醛，而GC-EAD的GC圖譜B氣譜峰對(duì)應(yīng)的蜀柏毒蛾性信息素化學(xué)成分為順-9-十八碳烯醇。順-9-十八碳烯醛和順-9-十八碳烯醇的GC-MS的成分峰的面積比為0.48∶0.52。鑒于昆蟲(chóng)性信息素結(jié)構(gòu)有較大的相似性，多數(shù)為長(zhǎng)鏈不飽和醇、乙酸脂、醛或酮類(lèi)，鏈長(zhǎng)一般為10(18碳[6]，故初步分析得出蜀柏毒蛾性信息素成分為順-9-十八碳烯醛和順-9-十八碳烯醇。

2.2 蜀柏毒蛾性信息素誘芯林間誘集

4種配方蜀柏毒蛾誘芯對(duì)蜀柏毒蛾5 d的誘集效果(見(jiàn)表1)，均表現(xiàn)出誘集性，其中順-9-十八碳烯醛∶順-9-十八碳烯醇=1∶9配方誘集效果最好;順-9-十八碳烯醛∶順-9-十八碳烯醇=1∶9(200 μg)和順-9-十八碳烯醛∶順-9-十八碳烯醇=9∶1(200 μg)之間誘集效果差異不顯著；但順-9-十八碳烯醛∶順-9-十八碳烯醇=1∶9(200 μg)和順-9-十八碳烯醛∶順-9-十八碳烯醇=9∶1(200 μg)與順-9-十八碳烯醇(200 μg)和順-9-十八碳烯醛(200 μg)的誘集效果差異顯著。

表1 4種配方蜀柏毒蛾性信息素誘芯誘集效果

Tab. 1 The total of males trapped by lures with four kinds of different components

誘芯組成誘集量(%)差異顯著性順-9-十八碳烯醛∶順-9-十八碳烯醇=1∶9(200μg)29.35±2.12 Aa順-9-十八碳烯醛∶順-9-十八碳烯醇=9∶1(200μg)25.28±0.52Aa順-9-十八碳烯醛(200μg)22.75±1.02Ab順-9-十八碳烯醇(200μg)18.35±0.48BcCK11.95±0.45Dd

注: 表中數(shù)據(jù)為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差。不同大、小寫(xiě)字母分別表示在 P < 0.05 和 P < 0.01 水平下差異顯著( Duncan 氏新復(fù)極差法) 。

3 討論

采用正己烷溶劑浸提蜀柏毒蛾處女雌蛾性信息素腺體的方法取得了對(duì)蜀柏毒蛾雄蛾觸角具有顯著電生理反應(yīng)的的活性粗提物[4]。從GC-EAD和GC-MS圖譜來(lái)看，所采用的傳統(tǒng)信息素溶劑浸提法可能造成性信息素成分受雜質(zhì)干擾，造成微量成分的缺失[5]，這些微量成分可能是蜀柏毒蛾性信息素的關(guān)鍵成分，對(duì)誘集效果起到增效作用，大大提高其誘集效果。

從昆蟲(chóng)信息素?cái)?shù)據(jù)庫(kù)來(lái)看，鱗翅目昆蟲(chóng)中已鑒定性信息素的毒蛾科的昆蟲(chóng)有8屬27種[6]，蜀柏毒蛾所屬的柏毒蛾屬的種類(lèi)尚無(wú)鑒定。因此，GC-EAD和GC-MS方法來(lái)準(zhǔn)確鑒定蜀柏毒蛾性信息素成分，缺乏相關(guān)比對(duì)資料，對(duì)結(jié)果的精準(zhǔn)性也帶來(lái)相當(dāng)難度。

對(duì)蜀柏毒蛾性信息成分的鑒定仍以GC-EAD和GC-MS分析，結(jié)合林間誘集試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。從試驗(yàn)結(jié)果分析，初步可以確定順-9-十八碳烯醛和順-9-十八碳烯醇是蜀柏毒蛾的性信息素主要成份，但其不同組分的誘集效果同蜀柏毒蛾處女雌蛾正己烷溶劑浸提法物誘芯比較，其誘集到的蜀柏毒蛾雄成蟲(chóng)的數(shù)量較少(另文發(fā)表)，可能蜀柏毒蛾性信息素成分還有其他關(guān)鍵成分沒(méi)有分析鑒定出來(lái)，所配制的蜀柏毒蛾性信息素誘芯組分還需不斷優(yōu)化調(diào)整。

致謝本實(shí)驗(yàn)的GC-EAD分析和GC-MS分析分別在中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所電生理實(shí)驗(yàn)室和化學(xué)分析室完成，并得到了中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所王睿老師在實(shí)驗(yàn)測(cè)試方面的技術(shù)幫助，謹(jǐn)致謝意。

[1] 馮波，周建華,等.一株蜀柏毒蛾無(wú)芽胞桿菌病原的鑒定與毒力研究[J]． 林業(yè)科學(xué),2009，45( 11) : 104～108.

[2] 周建華，等.不同波長(zhǎng)誘蟲(chóng)燈對(duì)蜀柏毒蛾成蟲(chóng)的誘集研究 四川林業(yè)科技，2013，34(6)：69～71.

[3] 蒙憲佐. 我國(guó)昆蟲(chóng)信息素研究與應(yīng)用的進(jìn)展 昆蟲(chóng)知識(shí)，2000，37(2)：75～84.

[4] 張坤勝, 楊偉, 卓志航，等. 蜀柏毒蛾生殖行為及性信息素產(chǎn)生與釋放節(jié)律. 昆蟲(chóng)學(xué)報(bào), 2006, 55(1): 46～54.

[5] 孔祥波, 趙莉藺, 張真, 等. 松毛蟲(chóng)性信息素的固相微萃取及質(zhì)譜和觸角電位分析. 昆蟲(chóng)學(xué)報(bào), 2010, 53(8): 857～863.

[6] 韋衛(wèi), 趙莉藺, 孫江華. 蛾類(lèi)性信息素研究進(jìn)展. 昆蟲(chóng)學(xué)報(bào), 2006, 49(5): 850～858.

APrelimiaryStudyoftheIdentificationofComponentsofSexPheromonefromParocneriaorientaChaoanditsTrappingEffectsintheField

ZHOU Jian-hua1WEI Wei2ZHAO Li-lin2XIAO Yin-bo1FAN Cheng-zhi1JIA Yu-zhen1MA Juan3

(1.Sichuan Academy of Forestry, Chengdu 610081, China; 2.State Key Laboratory of Integrated Management of Pest Insects and Rodents, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100080, China; 3.Langzhong Forestry Bureau,Langzhong 637400,China)

The sex pheromone was extracted from sex pheromone glands of virgin female moths ofP.orientaby n-hexane. The sensitive reaction of male moths antenna to the crude sex pheromon was detected by GC-EAD and the components of the sex gland extracts that consistently elicited antennal responses were identified by GC-MS. The results indicated that male moths antenna had sensitive reaction to two components of the extracts, which were Z-9-Octadacenal and Z-9-Octadacenol. In field trials, traps baited with either Z-9-Octadacenal or Z-9-Octadacenol alone caught a similar amount of male moths, which meant that Z-9-Octadacenal and Z-9-Octadacenol were the main components of the sex pheromone ofParocneriaorienta.thecombination of Z-9-Octadacenal and Z-9-Octadacenol in 1∶9 or 1∶9 ratio caught more males than single component traps.

Parocneriaorienta, Sex pheromone, Component identification, Trapping

2017-10-10

林業(yè)公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201004003)項(xiàng)目資助。

周建華(1964-)，男，四川彭州人，研究員，研究方向?yàn)樯植∠x(chóng)害。E-mail:760686496@qq.com。

10.16779/j.cnki.1003-5508.2017.06.003

S763.3

A

1003-5508(2017)06-0009-04