P16、Stathmin-1及Ki67在宮頸上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá)與意義

張晴 李丹 岳欣 朱菡 黃馨逸 王旭波(通訊作者)

221000南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬徐州市中醫(yī)院病理科

P16、Stathmin-1及Ki67在宮頸上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá)與意義

張晴 李丹 岳欣 朱菡 黃馨逸 王旭波(通訊作者)

221000南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬徐州市中醫(yī)院病理科

目的：探討P16、Stathmin-1、Ki67在宮頸上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá)與臨床意義。方法：收治宮頸病變患者92例作為觀察組，選擇20例慢性宮頸炎標(biāo)本作為對(duì)照組，均檢測(cè)P16、Stathmin-1、Ki67表達(dá)情況。結(jié)果：對(duì)照組P16、Stathmin-1及Ki67的陽性率顯著低于觀察組(P＜0.05)。直線相關(guān)性顯示，P16、Stathmin-1及Ki67表達(dá)都呈現(xiàn)兩兩正向相關(guān)性(P＜0.05)。結(jié)論：P16、Stathmin-1和Ki67在不同級(jí)別的宮頸上皮內(nèi)瘤變的病理診斷中有重要意義。

免疫組化技術(shù)；P16；Stathmin-1；Ki67；子宮頸上皮內(nèi)瘤變

宮頸癌是婦科腫瘤中的第二大惡性腫瘤，是由宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)漸進(jìn)性發(fā)展的一種腫瘤。CINⅠ在臨床上以隨訪為主，CINⅡ、CINⅢ臨床上則需要積極地手術(shù)治療。我們通常把常規(guī)病理診斷認(rèn)作是“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是，因?yàn)槿狈陀^依據(jù)，而且受到病理科醫(yī)師自身及彼此之間的可變性的因素影響，對(duì)宮頸鱗狀上皮病變的病理學(xué)診斷很大程度上會(huì)出現(xiàn)偏差，可導(dǎo)致臨床漏診或者過度治療。因此，為了提高宮頸病變?cè)\斷的準(zhǔn)確性，使用有效的生物學(xué)標(biāo)記物為組織病理學(xué)診斷提供客觀依據(jù)就顯得尤為重要[1-4]。而P16、Stathmin-1、Ki67在宮頸病變的過程中可以作用于細(xì)胞的周期，并參與細(xì)胞的增殖、分裂及腫瘤生成的過程，在臨床醫(yī)學(xué)中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。2015年10月-2017年5月收治宮頸上皮內(nèi)瘤變患者92例作為研究對(duì)象，探討宮頸內(nèi)皮上皮瘤變p16、Stathmin-1及Ki67的表達(dá)情況，并分析其臨床診斷價(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下。

資料與方法

對(duì)2015年10月-2017年5月于我院就診的首次行宮頸活檢手術(shù)的92例(觀察組)宮頸上皮內(nèi)瘤變患者行石蠟組織包埋，并且排除子宮次全切除后、既往有子宮疾病病史診療后的患者?；颊吣挲g20～74歲，平均36.67歲。其中，CINⅠ32例，CINⅡ30例，CINⅢ30例。選所有的切片均由資歷較深的兩名病理醫(yī)師共同閱片。慢性宮頸炎20例作為對(duì)照組。

檢測(cè)方法：所有標(biāo)本均用10%的中性甲醛固定，常規(guī)進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，然后連續(xù)4 μm厚度切片，行HE染色，在奧林巴斯CX31光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察，確定病理診斷及分組。P16、Stathmin-1和Ki67檢測(cè)采用免疫組織化學(xué)SP法，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格地按照試劑盒說明書進(jìn)行，以已知陽性片分別做P16、Stathmin-1和Ki67陽性對(duì)照染色，以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗做陰性對(duì)照染色。其中鼠抗人P16單克隆抗體、鼠抗人Stathmin-1單克隆抗體、鼠抗人Ki67單克隆抗體及SP法試劑盒等均為福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)。

判定標(biāo)準(zhǔn)：用光學(xué)顯微鏡觀察顯色反應(yīng)，在高倍鏡下(×400)對(duì)每一張切片隨機(jī)選擇具有代表性的5個(gè)視野，并且每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，一共計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞，然后計(jì)算每張切片陽性細(xì)胞數(shù)所占的百分比。①P16蛋白表達(dá)：細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，見圖1。②Stathmin-1蛋白表達(dá)：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)見到棕黃色顆粒為陽性，見圖2。③Ki67表達(dá)：細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒陽性，見圖3。④按照陽性細(xì)胞百分比的多少分4級(jí)：無陽性細(xì)胞(-)為0～10%，弱陽性(+)為10%～25%，中度陽性(++)，25%～50%，＞50%強(qiáng)陽性(+++)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采取SPSS 13.0分析，以Spearman相關(guān)分析比較患者P16、Stathmin-1及Ki67的表達(dá)關(guān)系，運(yùn)用秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)P16、Stathmin-1及Ki67在宮頸上皮內(nèi)瘤變中的表達(dá)差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

各種不同病變組織中P16和Ki67的表達(dá)：P16蛋白在對(duì)照組的陽性率為20%，顯著低于觀察組(CINⅠ、CINⅡ及CINⅢ)68.0%、100%及100%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。陽性表達(dá)強(qiáng)度結(jié)果顯示：CINⅠ、CINⅡ及CINⅢ之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且CINⅠ＜CINⅡ＜CINⅢ。表明P16的表達(dá)強(qiáng)度隨著病變的加重呈正相關(guān)。Stathmin-1蛋白在對(duì)照組的陽性率30%，顯著低于觀察組(CINⅠ、CINⅡ及CINⅢ)71%、93%及96%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。陽性表達(dá)強(qiáng)度上CINⅠ、CINⅡ及CINⅢ之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且CINⅠ＜CINⅡ＜CINⅢ。表明Stathmin-1的表達(dá)強(qiáng)度隨著病變的加重呈正相關(guān)。Ki67表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果顯示，Ki67在對(duì)照組的陽性率30%，顯著低于觀察組(CINⅠ、CINⅡ及CINⅢ)78%、96%及100%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。CINⅠ、CINⅡ及CINⅢ之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且CINⅠ＜CINⅡ＜CINⅢ。表明Ki67的表達(dá)強(qiáng)度與病變的加重呈正相關(guān)，見表1。

P16、Stathmin-1及Ki67三者間的關(guān)聯(lián)性：3種抗體在宮頸組織中的表達(dá)結(jié)果經(jīng)Spearman相關(guān)分析，P16陽性表達(dá)在慢性宮頸炎和CIN之間呈正相關(guān)(r=0.785，P＜0.05)；Stathmin-1陽性表達(dá)在慢性宮頸炎和CIN之間呈正相關(guān)(r=0.719，P＜0.05)；Ki67陽性表達(dá)慢性宮頸炎和CIN之間呈正相關(guān)(r=0.683，P＜0.05)。

表1 P16、Stathmin-1及Ki67在宮頸各型病變中的表達(dá)(n)

圖1 P16在CINⅡ的表達(dá)(SPx100)

圖2 Stathmin-1在CINⅡ的表達(dá)(SPx100)

圖3 Ki67在CINⅡ的表達(dá)(SPx100)

討 論

宮頸癌是婦科最常見得惡性腫瘤之一，其發(fā)病率有逐年上升及年輕化的趨勢(shì)，其中多數(shù)為鱗狀細(xì)胞癌，多數(shù)人認(rèn)為宮頸癌的發(fā)生與性生活過早、多產(chǎn)、多個(gè)性伴侶及HPV感染等因素有關(guān)[5]。但是宮頸癌的發(fā)展過程時(shí)間比較長(zhǎng)，病變的發(fā)展過程為長(zhǎng)期慢性宮頸炎-宮頸上皮內(nèi)瘤變-原位癌-浸潤(rùn)癌，尤其是癌前病變，病理上根據(jù)異型增生的細(xì)胞累及的宮頸鱗狀上皮的層次，分為CINⅠ、CINⅡ及CINⅢ。針對(duì)癌前病變進(jìn)行及時(shí)、準(zhǔn)確的分析，有利于預(yù)防與控制宮頸癌的發(fā)生。

P16基因是直接參與細(xì)胞周期調(diào)控的抑癌基因，P16基因的失活可使得宮頸上皮細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生紊亂，從而啟動(dòng)了一系列的癌變過程。P16基因定位于細(xì)胞核內(nèi)，屬于抑癌基因，編碼產(chǎn)物是16KD的蛋白，是作用于細(xì)胞分裂周期關(guān)鍵酶之一的CDK4的抑制因子，可以抑制細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生。本組資料顯示，CIN組中P16陽性表達(dá)率明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P16在宮頸CINⅡ及CINⅢ組陽性表達(dá)率明顯高于宮頸CINⅠ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此結(jié)果與顧依群等的報(bào)道相近[6]，數(shù)據(jù)表明P16的表達(dá)隨著宮頸病變的級(jí)別上升而表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)，與既往研究結(jié)果一致[7，8]，是宮頸上皮內(nèi)瘤變病理診斷的很好的補(bǔ)充[9]，有效提高了對(duì)早期宮頸病變進(jìn)展的預(yù)測(cè)效果，從而可以對(duì)這部分患者進(jìn)行密切監(jiān)測(cè)及早期干預(yù)治療。

Stathmin-1是一種微管解聚蛋白，調(diào)節(jié)微管動(dòng)力和紡錘體的形成，影響細(xì)胞的有絲分裂，從而改變細(xì)胞周期分布，影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。Brooke等研究證實(shí)Stathmin-1在宮頸上皮內(nèi)瘤變高表達(dá)，且與病變級(jí)別相關(guān)[10]。本研究中Stathmin-1在慢性宮頸炎中的陽性表達(dá)率30%，在CINⅠ中的陽性表達(dá)率71%，在CINⅡ級(jí)中的陽性表達(dá)率93%，在CINⅢ級(jí)中的陽性表達(dá)率96%，總體陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。本研究中CIN組織中Stathmin-1與P16蛋白表達(dá)有正相關(guān)性，與Howiitt等的報(bào)道一致[11]。所以Stathmin-1協(xié)同P16檢測(cè)可提高宮頸上皮內(nèi)病變的分級(jí)準(zhǔn)確率。

Ki67是表達(dá)于增殖期細(xì)胞的核抗原，參與細(xì)胞周期的調(diào)控。Ki67主要用于判斷細(xì)胞的增殖活性，可在除G0期外的活動(dòng)周期(Gl、S、G2和有絲分裂期)中表達(dá)，被公認(rèn)為是能夠準(zhǔn)確且可靠反映細(xì)胞增殖活性的客觀指標(biāo)。本研究中，Ki67在慢性宮頸炎、CINⅠ、CINⅡ及CINⅢ中的陽性表達(dá)率分別為30%、78%、96%、100%，且陽性的強(qiáng)度隨著病變級(jí)別的升高而越來越強(qiáng)。Mimica等研究發(fā)現(xiàn)[12]，Ki67檢測(cè)可預(yù)測(cè)hrHPV感染，且Ki67蛋白與CIN程度相關(guān)，在CINⅡ、CINⅢ中的表達(dá)更高，說明Ki-67檢測(cè)是使CIN分類更準(zhǔn)確的輔助方法。近些年來，有些學(xué)者在對(duì)CIN的研究中，發(fā)現(xiàn)P16和Ki67兩種蛋白的表達(dá)在CIN病變中呈正相關(guān)[13]，提示宮頸腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多基因突變的結(jié)果，并且提示P16和Ki67在宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中具有協(xié)同作用，因此聯(lián)合檢測(cè)P16和Ki67，可作為CIN分級(jí)診斷的輔助方法。

綜上所述，宮頸上皮內(nèi)瘤變是多基因、多因素共同作用的結(jié)果，準(zhǔn)確、客觀地診斷宮頸腫瘤和分級(jí)對(duì)臨床上進(jìn)一步治療以及預(yù)后評(píng)價(jià)是非常重要的。本研究結(jié)果顯示，CIN組中聯(lián)合檢測(cè)P16、Stathmin-1和Ki-67，可以輔助CIN的病理診斷，提高CIN的診斷準(zhǔn)確率，使診斷更加客觀，為以后的治療方案提供合理依據(jù)，進(jìn)而可以減輕患者的精神及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。美國(guó)陰道鏡協(xié)會(huì)及CAP頒布的專家共識(shí)中提出，在判斷宮頸高、低級(jí)別CIN中，P16被公認(rèn)為是有診斷意義的標(biāo)記，而Stathmin-1作為一個(gè)新的指標(biāo)是否能單獨(dú)作為診斷參考指標(biāo)還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

[1]Zhong PP,Li JF,Gu YQ,et al.p16 and Ki-67 expression improves the diagnosticaccuracy of cervical lesions but not predict persistent high risk human papillomavirus infection with CINⅠ[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(3):2979-2986.

[2]Yang QC,Zhu Y,Liu HB,et al.A cocktail of MCM2 and TOP2A,p16 INK4a and Ki-67 as biomarkers for the improved diagnosis of cervical intraepithelial lesion[J].Pol J Pathol,2013,1:21-27.

[3]Bergeron C,Ordi J,Schmidt D,et al.Conjunctive p16 INK4a testing significantly increases accuracy in diagnosing high-grade cervical intraepithelial aeoplasia[J].Am J Clin Pathol,2010,133:395-406.

[4]Nuno T,Garcia F.The LAST project and its implications for clinical care[J].Obstet Gynecol Clin North Am,2013,40(2):225.

[5]Jiang B,Xue M.Correlation of E6 and E7 levels in high-risk HPV16 type cervical lesions with CCL20 and Langerhans cells[J].Genet Mol Res,2015,14(3):10473-10481.

[6]顧依群,高子芬,汪穎南,等.人乳頭狀瘤病毒、P16INK4A在宮頸鱗狀上皮病變中的意義[J].病理診斷學(xué)雜志,2008,15(4):315-317.

[7]黃惠英,錢德英,岑堅(jiān)敏.免疫組化P16蛋白在不同級(jí)別宮頸病變中表達(dá)差異的研究[J].現(xiàn)代醫(yī)院,2008,8(3):14-15.

[8]劉艷君,臧春逸.P16INK4a、Ki-67在宮頸上皮病變組織中的表達(dá)規(guī)律及其與HPV負(fù)荷量的相關(guān)性研究[J].北京醫(yī)學(xué),2011,33(11):904-907.

[9]鐘玲,賴妙玲,唐甜,等.不同級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變中p16、p53及Ki-67的表達(dá)及意義[J].廣東醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2015,33(5):565-568.

[10]Brooke EH,Marisa R.Stathmin-1 expression as a complement to p16 helps identify high-grade cervical intraepithelial neoplasia with increased specificity[J].Am J Surg Pathol,2013,37(1):89-97.

[11]Howitt BE,Nucci MR,Drapkin R,et al.Stathmin-1 Expressionasa ComplementtP16 Helps Identify High-grade Cervical Intraepithelia Neoplasia With Increased Specificity[J].The American Journal of Surgical Pathology,2013,37:89-97.

[12]Mimica M,Tomi S,Kardum G,et al.Ki-67 quantitative evaluation as a marker of cervical intraepithelial neoplasia and human papillomavirus infection[J].Int J Gynecol Cancer,2010,20(1):116-119.

[13]何慧儀,盧麗娜,杜洪,等.Ki67、Survivin、P16表達(dá)在宮頸癌和宮頸癌前病變?cè)\斷中的意義[J].中國(guó)婦幼保健,2006,21(13):1825.

Expression and significance of P16,Stathmin-1 and Ki67 in cervical intraepithelial neoplasia

Zhang Qing,Li Dan,Yue Xin,Zhu Xi,Huang Xinyi,Wang Xubo(Corresponding author)
Department of Pathology,the Traditional Chinese Medicine Hospital of Xuzhou City Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine 221000

Objective:To explore the expression and significance of P16,Stathmin-1 and Ki67 in cervical intraepithelial neoplasia.Methods:92 patients with cervical lesions were selected as the observation group.20 cases of chronic cervicitis specimens were selected as the control group.The expressions of P16,Stathmin-1 and Ki67 were detected.Results:The positive rates of P16,Stathmin-1 and Ki67 in the control group were significantly lower than those in the observation group(P＜0.05).Linear correlation showed that the expression of P16,Stathmin-1 and Ki67 showed positive correlation with each other(P＜0.05).Conclusion:P16,Stathmin-1 and Ki67 had important significance in the pathological diagnosis of different grades of cervical intraepithelial neoplasia.

Immunohistochemical technique;P16;Stathmin-1;Ki67;Cervical intraepithelial neoplasia

10.3969/j.issn.1007-614x.2017.34.74