殼聚糖支架負(fù)載SHH和CM—Dil標(biāo)記的脂肪干細(xì)胞移植后存活分化研究

羅鳴驁 伍尚敏 蘇曉三 高嘉 于璐 王翼寅 甘鳳山

[摘要]目的：觀察殼聚糖支架負(fù)載音猬因子（Sonic hedgehog，SHH）和脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells， ADSCs）移植后，ADSCs存活分化的效果。方法：將健康C57BL/6小鼠隨機(jī)分為A組（PBS+ADSCs）、B組（SHH+ADSCs）、C組（殼聚糖+ADSCs）、D組（殼聚糖+SHH+ADSCs）。將各組混合物分別注射到小鼠背部皮下。術(shù)后1、2、4、8周處死小鼠，通過對移植組織一般觀察、熒光顯微鏡觀察、HE染色、免疫組化染色來評價(jià)移植細(xì)胞存活分化的情況。結(jié)果：術(shù)后8周，殼聚糖支架完全降解，大體觀察、HE染色、免疫組化染色均說明殼聚糖支架同時(shí)搭載SHH和ADSCs脂肪干細(xì)胞存活率較高，新生血管增加，效果均優(yōu)于A、B、C三組。結(jié)論：殼聚糖支架同時(shí)負(fù)載SHH和ADSCs可有效促進(jìn)干細(xì)胞存活，顯著增加血管組織數(shù)量。

[關(guān)鍵詞]可注射性；殼聚糖；音猬因子；脂肪干細(xì)胞；干細(xì)胞移植

[中圖分類號]R329 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）10-0129-04

Abstract： Objective The aim of our research is to observe the survival and differentiation of adipose Derived stem cells after transplantation with injectable chitosan scaffold loaded with SHH and adipose stem cells. Methods Thirty healthy C57BL/6 mice were selected. Random division group A mixture of PBS and ADSCs，group B mixture of SHH and ADSCs，group C chitosan scaffold loaded with ADSCs，group D chitosan scaffold loaded with SHH and ADSCs.After 1，2，4 and 8 weeks analysis involved general observation，HE staining，immunohistochemical staining of the survival and differentiation of transplanted cells. Results Eight weeks after operation， chitosan scaffold were completely degraded. After 8 weeks，analysis involved general observation，HE staining and immunofluorescence staining showed that Chitosan scaffold loaded with SHH and ADSCs could effectively increase the survival rate of adipose stem cells，increase angiogenesis. All the results were better than that of A、B、C group. Conclusion Chitosan scaffold loaded with SHH and ADSCs can effectively promote the survival of stem cells and spontaneously differentiate into mature adipocytes and increase the number of vascular tissues.May serve as a promising strategy for improving the survival of ADSCs graft survival rate.

Key worlds： syringeability； chitosan； SHH； adipose stem cells； stem cell transplantation

自體游離脂肪是臨床上較安全的軟組織修復(fù)填充材料，但脂肪移植后微血管被破壞，組織處于缺血期，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[1]，致其存活率降低，臨床應(yīng)用受到極大限制。脂肪干細(xì)胞以其來源豐富、易獲取、能在體外多代穩(wěn)定增殖、具有多向分化潛能、免疫相容性好、取材對患者損傷小等優(yōu)點(diǎn)已成為臨床研究熱點(diǎn)[2-3]。單純干細(xì)胞移植，因細(xì)胞缺乏粘附點(diǎn)呈漂浮狀態(tài)，即缺乏良好的移植微環(huán)境，不利于細(xì)胞的存活和正常功能的發(fā)揮。殼聚糖因其生物降解性、非抗原性、無毒性，抗菌活性以及良好的生物粘附性和細(xì)胞親和力，被廣泛用作細(xì)胞載體[4]。本實(shí)驗(yàn)將ADSCs同時(shí)或分別混合SHH和殼聚糖支架，注射入小鼠的背部皮下，觀察細(xì)胞移植后存活分化的效果。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及材料：實(shí)驗(yàn)動物：健康雌性C57BL/6小鼠20只，體重18～22g，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部提供。主要試劑：胎牛血清（德國Capricorn Scientific），L-DMEM培養(yǎng)基（美國hyclone），DMSO（美國sigma），PBS（美國gibco），D-PBS（美國gibco），I型膠原酶（北京索萊寶科技有限公司），CM-Dil（美國Invitrogen），SHH（美國R&D;），即用型一抗（丹麥Dako），殼聚糖（美國sigma），tunel試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠ADSCs原代培養(yǎng)及鑒定：C57BL/6小鼠斷頸處死后取腹股溝處脂肪組織，參照陳軍等[5]的方法進(jìn)行ADSCs的分離培養(yǎng)，傳至第五代，行流式細(xì)胞儀檢測及成脂成骨分化鑒定。

1.2.2 殼聚糖支架的制備：參考伍尚敏等[6]殼聚糖備制流程加以改進(jìn)，在磁力攪拌結(jié)束后，將溶液加入12孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔中，1ml/孔。置于-20℃中過夜，取出后冷凍干燥48 h。用75%乙醇浸泡0.5h滅菌，并剪碎為小顆粒，PBS浸洗3次，15min/次，最后在密封條件下紫外燈照射20min。

1.2.3 CM-Dil染色：將消化后的細(xì)胞用PBS沖洗兩次。標(biāo)記液50?g CM-Dil加入0.025ml二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO），用D-PBS配制為5?g/ml染液，將細(xì)胞與染液混合，37℃溫箱孵育20min，4℃冰箱孵育15min。標(biāo)記成功后PBS再次沖洗，用PBS配制成混合懸濁液備用。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組及手術(shù)：隨機(jī)分為4組：即A組：空白對照組（PBS+ADSCs）、B組：干細(xì)胞-SHH組（ADSCs+SHH）、C組：殼聚糖-干細(xì)胞組（殼聚糖+ADSCs）、D組：實(shí)驗(yàn)組（殼聚糖+SHH+ADSCs），每組小鼠各5只。將CM-Dil標(biāo)記的ADSCs與殼聚糖支架及SHH混合，混合物SHH終濃度300?g/L，用注射器吸取ADSCs-SHH-殼聚糖支架，1%戊巴比妥鈉70?l/只，腹腔注射麻醉小鼠，選取背部四點(diǎn)（每點(diǎn)含干細(xì)胞數(shù)目約為8×105個(gè)），將混合物注射入小鼠背部皮下，注射完可見到皮下有輕微隆起，其余各組移植方法相同。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 標(biāo)本處理和組織學(xué)觀察：OCT組織包埋劑包埋后制作冰凍切片，熒光顯微鏡觀察。其余組織使用多聚甲醛溶液固定脫水后制成蠟塊。

1.3.2 HE染色：取上述各組組織石蠟切片，蘇木精-伊紅常規(guī)染色，觀察計(jì)數(shù)完整的細(xì)胞數(shù)。

1.3.3 免疫組化染色檢測CD31、CD34及計(jì)數(shù)：石蠟切片使用二甲苯脫蠟，乙醇逐級脫水。微波修復(fù)抗原，PBS沖洗；3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化氫酶，一抗過夜孵育，PBS沖洗；二抗孵育，PBS，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分化。脫水、透明、封片、鏡檢。標(biāo)本組織HE染色切片，CD31、CD34免疫組化切片均使用Precipoint M8掃描，然后使用網(wǎng)格測試系統(tǒng)，在400倍鏡視野下隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs流式檢測成骨成脂誘導(dǎo)分化：鏡下觀察細(xì)胞呈梭形或多邊形。流式結(jié)果顯示CD44、CD90高表達(dá)，CD34、CD45低表達(dá)（見圖1），同時(shí)成脂成骨分化鑒定（見圖2），證實(shí)培養(yǎng)細(xì)胞為ADSCs。

2.2 殼聚糖支架的性能：電鏡下觀察殼聚糖支架呈現(xiàn)疏松多孔結(jié)構(gòu)（見圖3a），且殼聚糖支架與ADSCs共同培養(yǎng)結(jié)果顯示ADSCs可以大量存活并粘附于殼聚糖支架表面（見圖3b）。

2.3 熒光顯微鏡結(jié)果：組織冰凍切片觀察顯示脂肪干細(xì)胞大量存活，白光下可見被染色的干細(xì)胞（見圖4a），在同一視野熒光顯微鏡下，呈現(xiàn)較強(qiáng)的紅色熒光（見圖4b）。第四周仍可見熒光存在。

2.4 HE染色：干細(xì)胞在殼聚糖支架周圍及內(nèi)部大量存活，較單純移植組細(xì)胞存活更多。第4周脂肪干細(xì)胞逐步分化為脂肪細(xì)胞，并形成以殼聚糖干細(xì)胞混合體為核心的發(fā)生中心（見圖5）。第8周殼聚糖已被完全降解，在40倍鏡下對完整細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)顯示各組存活移植細(xì)胞數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，除C、D組P<0.05，其余各組均P<0.01。殼聚糖同時(shí)負(fù)載SHH與ADSCs組與其他組相比存活細(xì)胞數(shù)顯著提高（P<0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖6）。

2.5 免疫組化結(jié)果：各組脂肪組織切片上均可見被標(biāo)記為棕色的細(xì)胞。由于ADSCs的CD31、CD34表達(dá)均呈陰性，可以判斷標(biāo)記細(xì)胞為新生血管內(nèi)皮細(xì)胞。CD31顯示第1周實(shí)驗(yàn)組分化出大量新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，分布廣泛均勻（見圖7a），各組新生內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。CD34顯示第8周實(shí)驗(yàn)組已形成大量單層內(nèi)皮新生血管組織（見圖7b），各組血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，除B、C組P<0.05，其余各組P<0.01（見圖8）。

3 討論

自體脂肪組織移植是整形外科手術(shù)中增加組織體積和輪廓缺損的一種安全而簡便的選擇[7]。但自體脂肪移植存在注射后吸收率高，脂肪細(xì)胞易死亡，液化壞死的脂肪組織可導(dǎo)炎癥及感染等諸多問題[8]。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用的脂肪干細(xì)胞（ADSCs）是從脂肪組織中分離的一種間充質(zhì)干細(xì)胞，具有多向分化潛能[9]，脂肪干細(xì)胞相對于成熟脂肪細(xì)胞具有強(qiáng)大的增殖分化潛力，對缺氧耐受力更強(qiáng)，且自體干細(xì)胞用于移植可避免排異反應(yīng)，更加安全。脂肪干細(xì)胞來源豐富，提取方便，創(chuàng)口小，可與抽脂手術(shù)同時(shí)進(jìn)行，且脂肪干細(xì)胞能自發(fā)地或經(jīng)誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞[10]。Zhang等[11]實(shí)驗(yàn)證明體內(nèi)移植的脂肪干細(xì)胞完全代謝大約需要28d，本實(shí)驗(yàn)在注射ADSCs后檢測周期遠(yuǎn)大于28d，達(dá)到8周，這樣既可以保證干細(xì)胞充分發(fā)揮其作用，也可以在一定程度上了解其遠(yuǎn)期效果。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用CM-Dil熒光染料為移植脂肪干細(xì)胞的示蹤劑，其是一種親脂性染料，不溶于水，不從已標(biāo)記的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到未標(biāo)記的細(xì)胞，對活體細(xì)胞沒有任何毒性[12]。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的殼聚糖支架原料脫乙酰殼聚糖是一種從甲殼類生物外骨骼中提取的天然線性多糖，具有良好生物官能性和相容性。在體內(nèi)不積累，無免疫原性，可在體內(nèi)溶菌酶、甲殼酶的作用下水解成對人體無毒的N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖。殼聚糖支架表面可形成大量微小的孔隙，可顯著提高細(xì)胞粘附[13]，為細(xì)胞生長提供一個(gè)三維立體培養(yǎng)的生長環(huán)境，而不是單純注射移植后所呈現(xiàn)的單層或漂浮狀態(tài)，使組織液更容易滲透到移植部位，維持細(xì)胞養(yǎng)分和氧氣供給，更利于移植細(xì)胞的早期存活和正常功能的發(fā)揮。實(shí)驗(yàn)中筆者發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞在殼聚糖支架周圍及內(nèi)部大量存活，較單純移植組細(xì)胞存活更多，說明殼聚糖對脂肪干細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。Su X等[10]提出的脂肪起源于筋膜的模型，其在筋膜組織中發(fā)現(xiàn)大量脂肪干細(xì)胞及脂肪前體細(xì)胞。移植后第4周脂肪干細(xì)胞逐步分化為脂肪細(xì)胞，并形成以殼聚糖干細(xì)胞混合體為核心的發(fā)生中心，此種現(xiàn)象在殼聚糖-ADSCs組及殼聚糖-SHH-ADSCs均有發(fā)生，據(jù)此可以認(rèn)為搭載有脂肪干細(xì)胞的殼聚糖支架形成了類似于筋膜組織的脂肪發(fā)生中心。

通過特定生長因子可抑制細(xì)胞的凋亡及自噬過程，明顯減少移植細(xì)胞死亡[14]。本實(shí)驗(yàn)選用的生長因子—音猬因子屬于Hh蛋白家族，對多種器官的形態(tài)發(fā)生分化起重要作用。SHH信號在血管發(fā)生中起關(guān)鍵作用。Hh信號通過血管生長因子調(diào)節(jié)血管的穩(wěn)定性，SHH信號蛋白顯著增加血管生成相關(guān)因子，包括VEGF，F(xiàn)GF和Ang[15]。SHH有助于血管平滑肌細(xì)胞的增殖[16]。SHH途徑刺激促進(jìn)血管生成因子的分泌，如激活素A、血管生成素、血管生成素1、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、基質(zhì)金屬甲縮肽酶-9和尿激酶型纖溶酶原激活物，可以在體外和體內(nèi)增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞的促血管生成能力[17]。SHH可直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞或刺激血管支持細(xì)胞產(chǎn)生無關(guān)生長因子，在血管瘤中高表達(dá)[18]。SHH作用于皮膚脂肪生成所必需的前脂肪，在缺乏SHH的皮膚中，關(guān)鍵的脂肪形成基因Pparg被下調(diào)[19]。免疫組化結(jié)果顯示第1周實(shí)驗(yàn)組分化出大量新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，分布廣泛均勻，第8周實(shí)驗(yàn)組已形成大量單層內(nèi)皮新生血管組織，各組血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其促進(jìn)了脂肪細(xì)胞生長，顯著提高了移植細(xì)胞部位的新生血管數(shù)量，提供了充足的血供，為移植細(xì)胞長期生存、功能的發(fā)揮提供了保障。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ADSCs-SHH-殼聚糖支架移植在增加細(xì)胞存活率，促進(jìn)血管新生均具有顯著作用。其原因可能為：殼聚糖支架提供了良好的細(xì)胞生長微環(huán)境，促進(jìn)了ADSCs存活分化和正常功能的發(fā)揮。SHH能促進(jìn)血管新生，從而減緩凋亡、壞死及退行性變性，促進(jìn)干細(xì)胞增殖，殼聚糖支架與SHH可以分別在移植早期和晚期保證移植細(xì)胞的供血供氧，其聯(lián)合作用為細(xì)胞的存活及功能發(fā)揮提供了有利條件。

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[收稿日期]2018-08-24 [修回日期]2018-09-20

編輯/賈敏