A型肉毒素預(yù)防人瘢痕成纖維細(xì)胞增生機(jī)制的初步研究*

郝榮濤，李宗超，陳 興，葉 偉

(重慶市中醫(yī)院皮膚美容科 400021)

論著·臨床研究

A型肉毒素預(yù)防人瘢痕成纖維細(xì)胞增生機(jī)制的初步研究*

郝榮濤，李宗超，陳 興，葉 偉△

(重慶市中醫(yī)院皮膚美容科 400021)

目的探究不同濃度A型肉毒素(BTX-A)對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞的影響，初步闡釋BTX-A治療瘢痕及預(yù)防術(shù)后瘢痕增生的相關(guān)分子作用機(jī)制。方法選取人瘢痕成纖維細(xì)胞，以不同濃度的BTX-A(0.01、0.10、1.00 U/L 及10.00 U/L)作用24 h后，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞黏附及骨架變化，并采用MTT及流式技術(shù)檢測(cè)其增殖、凋亡及周期變化，同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRCR)及蛋白免疫印跡(Western blot)方法，探究TGF-β、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1、 MMP-2及MMP-9基因及蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果隨著BTX-A劑量的升高，其細(xì)胞黏附數(shù)量及骨架熒光強(qiáng)度逐漸減弱；細(xì)胞增殖能力減弱且主要阻斷在細(xì)胞G0/G1期；此外其凋亡也隨著BTX-A劑量增大而逐漸增強(qiáng)。qPCR及Western blot結(jié)果顯示，隨著BTX-A劑量增大，MMP-1及MMP-2基因及蛋白均呈現(xiàn)高表達(dá)，而TGF-β及MMP-9呈現(xiàn)出低表達(dá)。結(jié)論BTX-A通過阻斷瘢痕細(xì)胞G0/G1期抑制其增殖，同時(shí)提高M(jìn)MP-1及MMP-2的表達(dá)來減輕瘢痕形成，對(duì)瘢痕的治療起著積極的作用。

肉毒桿菌毒素,A型；瘢痕細(xì)胞；成纖維細(xì)胞；分子機(jī)制

瘢痕是當(dāng)今國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界一直未攻克的難題，由于其發(fā)病率及術(shù)后復(fù)發(fā)率高，對(duì)患者的身心健康影響較大，且尚無行之有效的治療手段[1-4]。當(dāng)前注射治療的藥物主要為曲安奈德等激素，有效率較高，但藥物本身有較多的不良反應(yīng)[5-6]。而A型肉毒素(botulinum toxin type A，BTX-A)的安全性得到了大量臨床研究的證實(shí)，不良反應(yīng)較小，應(yīng)用于手術(shù)切口能促進(jìn)切口愈合，并且可以減輕傷口瘢痕或瘢痕增生的程度[7]；但BTX-A對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞具體的影響及其對(duì)瘢痕細(xì)胞調(diào)控的分子及其機(jī)制目前還尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過不同濃度的BTX-A作用于瘢痕成纖維細(xì)胞，初步探究其影響及分子作用機(jī)制，為BTX-A在瘢痕防治領(lǐng)域的臨床運(yùn)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 本研究選用的細(xì)胞為原代培養(yǎng)的人瘢痕成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)血清為杭州四季青有限公司胎牛血清，DMEM低糖培養(yǎng)基購自Hyclone公司。實(shí)驗(yàn)中采用的BTX-A購于蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司(國藥準(zhǔn)字S10970037)，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑為美國Sigam公司產(chǎn)品，免疫熒光中細(xì)胞骨架抗體Actin-tracker Green為上海碧云天生物有限公司產(chǎn)品。引物由上海生物有限公司合成，PCR采用的反轉(zhuǎn)錄及相關(guān)試劑盒均購于美國Promega公司。蛋白免疫印跡(Western blot)中需要的一抗及貨號(hào)信息見表1，細(xì)胞凋亡Annexin V/碘化丙啶(PI)試劑盒、辣根過氧化物標(biāo)記的山羊抗鼠及山羊抗兔二抗均購于武漢博士德生物有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將前期原代培養(yǎng)的瘢痕成纖維細(xì)胞復(fù)蘇，并在含10%的胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)基中孵箱2～3 d后傳代，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞增殖 取生長(zhǎng)及形態(tài)良好的細(xì)胞，胰酶消化重懸后以每孔1×105/100 μL的密度接種到96孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到50%融合后去除培養(yǎng)基，用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，加入提前配置好的含有不同濃度BTX-A的培養(yǎng)基，分別是0、0.01、0.1、1.0 U/L及10 U/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后采用MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，檢測(cè)其570 nm吸光度(A)值。

表1 一抗相關(guān)信息

1.2.3細(xì)胞形態(tài)變化觀察 取生長(zhǎng)及狀態(tài)良好的瘢痕成纖維細(xì)胞消化重懸后接種于鋪有無菌蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)到70%融合后去除培養(yǎng)基，無菌PBS清洗后加入不同濃度梯度BTX-A的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后移去培養(yǎng)基，無菌PBS清洗，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%Triton-X處理10 min，加入正常山羊血清封閉30 min，不洗加入稀釋比例為1∶100的Actin-tracker Green，保濕暗盒放置2 h，PBS清洗，DAPI染核5 min，抗熒光猝滅劑封片，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4細(xì)胞周期及凋亡檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)及處理方法同前，細(xì)胞經(jīng)過不同濃度的BTX-A處理后，4 ℃低溫離心5 min收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞3次，繼續(xù)離心，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL。然后去除上清液，加入70%的乙醇固定3 h，PBS清洗后加入RNAse A,并在37 ℃水浴30 min，最后加入400 μL的碘化丙啶(PI)液混勻，避光0.5 h后上機(jī)檢測(cè)周期變化。細(xì)胞在計(jì)數(shù)后，加入500 μL結(jié)合緩沖液用于凋亡檢測(cè)，用5 μL Annexin V-FITC和10 μL的PI保濕濕暗盒中孵育5 min后400目篩網(wǎng)過濾后上機(jī)檢測(cè)，Winmdi軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.5qPCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá) 細(xì)胞經(jīng)不同濃度BTX-A處理后采用 Trizol 試劑提取總RNA，電泳鑒定 RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度，以1 μg RNA總量反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；在 PE5700 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增。反應(yīng)總體系 20 μL，qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各1.0 μL，cDNA 2.0 μL，ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；93 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用相對(duì)定量2-ΔΔCt法比較各組細(xì)胞相關(guān)基因水平。引物序列見表2。

1.2.6Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 細(xì)胞經(jīng)不同濃度BTX-A處理后，用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，使用 BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)樣品蛋白濃度，取 30～50 μg 總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用 5%脫脂奶粉封閉 2～4 h，一抗于4 ℃條件下過夜，二抗室溫孵育2 h。其后采用ECL 顯色試劑盒于凝膠成像儀中觀察相關(guān)蛋白表達(dá)情況。最后采用Image J軟件對(duì)Western blot條帶進(jìn)行分析。

表2 引物序列

2 結(jié) 果

2.1BTX-A影響細(xì)胞黏附及形態(tài)變化 與BTX-A相比，BTX-A各處理組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。0 U/L組細(xì)胞貼附較好，鋪展較開，呈現(xiàn)出規(guī)律排列。隨著BTX-A劑量的升高，細(xì)胞貼附面積逐漸變小且具有逐漸脫落的趨勢(shì)，整體細(xì)胞形態(tài)相比0 U/L組細(xì)小。從各個(gè)視野細(xì)胞核的數(shù)量來看，隨著BTX-A劑量的增加其細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，見圖1。

圖1 激光共聚焦顯微鏡觀察不同濃度BTX-A作用

2.2細(xì)胞增殖變化情況 在不同濃度BTX-A處理后，細(xì)胞增殖具有較大變化。與0 U/L組比較0.01 U/L組細(xì)胞增殖能力具有輕微增加的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。當(dāng)濃度達(dá)到0.10 U/L時(shí)，細(xì)胞增殖明顯降低，且隨著BTX-A劑量的增加，增殖能力進(jìn)一步降低，各組與0 U/L組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

a：P<0.01

圖2不同濃度BTX-A作用瘢痕成纖維細(xì)胞后細(xì)胞增殖能力變化情況

2.3細(xì)胞周期變化及凋亡情況 與0 U/L組相比，BTX-A各處理組細(xì)胞G0/G1期明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3。BTA-A各處理組細(xì)胞總凋亡率與0 U/L組比較增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但早期凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表3 各處理組細(xì)胞周期變化情況

a:P<0.01,與0 U/L組比較

表4 各處理組細(xì)胞凋亡變化情況

a:P<0.01,與0 U/L組比較

2.4基因表達(dá)變化情況 瘢痕細(xì)胞經(jīng)BTX-A處理后，MMP-1與MMP-2的表達(dá)逐漸升高。當(dāng)BTX-A濃度達(dá)到1.00 U/L時(shí)，與0 U/L組相差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而TGF-β及MMP-9的表達(dá)隨著BTX-A濃度的增加而出現(xiàn)低表達(dá)的趨勢(shì)，且具有明顯的劑量效應(yīng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

2.5蛋白表達(dá)變化情況 BTX-A各處理組MMP-1蛋白的表達(dá)與0 U/L組比較明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；但其余各濃度梯度組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。MMP-2蛋白的表達(dá)也呈現(xiàn)出高表達(dá)趨勢(shì)，與0 U/L組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；此外，1.00 U/L組與10.00 U/L組表達(dá)量也明顯較0.01 U/L及0.10 U/L高。BTX-A各處理組TGF-β及MMP-9均有表達(dá)降低的趨勢(shì)，但BTX-A各處理組MMP-9表達(dá)與0 U/L組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，然而0.10 U/L組TGF-β與0 U/L組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。

A：MMP-1;B:MMP-2;C:MMP-9;D:TGF-β；a：P<0.05；b：P<0.01，與0 U/L比較

圖3不同濃度BTX-A作用瘢痕成纖維細(xì)胞后MMP-1、MMP-2、MMP-9及TGF-β基因表達(dá)

A：Western blot；B:半定量分析結(jié)果；a：P<0.01

圖4不同濃度BTX-A作用瘢痕成纖維細(xì)胞后MMP-1、MMP-2、MMP-9及TGF-β蛋白表達(dá)變化

3 討 論

正常的創(chuàng)傷后瘢痕為平坦的、相對(duì)狹窄的線性瘢痕。當(dāng)傷口過度修復(fù)，發(fā)生增生性病變，便發(fā)展為增生性瘢痕和瘢痕疙瘩[8-9]。瘢痕疙瘩為皮膚損傷后，結(jié)締組織過度增生和透明變性而引起的良性皮膚腫瘤，為機(jī)體異常愈合的一種形式，有類似腫瘤無限增殖生長(zhǎng)的方式[10]。其表現(xiàn)為皮膚損傷后，以膠原和大量細(xì)胞外基質(zhì)的形成，在局部過度沉積。其原因?yàn)轳：鄹泶裰心z原酶的活性高于正常皮膚，如Ⅰ型膠原的合成增加，使大量膠原沉積[11]。目前還不能確定其精確的發(fā)病機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，采用BTX-A作用于瘢痕成纖維細(xì)胞后細(xì)胞形態(tài)及黏附能力明顯發(fā)生變化，其增殖能力降低。這對(duì)預(yù)防瘢痕的過度增生有著積極的作用。

BTX-A是肉毒梭狀芽孢桿菌在繁殖過程中分泌的毒性蛋白質(zhì)，為一種細(xì)胞外毒素，能特異性阻斷乙酰膽堿釋放，未稀釋的原藥具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性[12]。根據(jù)抗原性的不同，可將其分為A、B、C、D、E、F、G 共7個(gè)亞型，而用于皮膚美容的為BTX-A。其相對(duì)分子質(zhì)量為90×103，屬于高分子蛋白質(zhì)[13]?，F(xiàn)有研究表明，BTX-A能抑制人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖和膠原蛋白的合成[1]。應(yīng)用于手術(shù)切口能降低局部張力，促進(jìn)切口愈合，可以減輕傷口瘢痕或瘢痕增生的程度。在不影響創(chuàng)面愈合的時(shí)間和速度的情況下，可下調(diào)大鼠TGF-β的表達(dá)[14]，同時(shí)也能影響人瘢痕組織TGF-β的生成[15]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，BTX-A作用瘢痕成纖維細(xì)胞后其細(xì)胞骨架牽張力明顯變小，細(xì)胞骨架與對(duì)照組相比呈現(xiàn)出明顯的收縮狀。這也證實(shí)了BTX-A對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞牽張力的影響。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，BTX-A作用瘢痕細(xì)胞后，TGF-β基因及蛋白的表達(dá)均明顯下調(diào)。此外從MMP-1、MMP-2及MMP-9基因及蛋白的表達(dá)情況來看，前兩者出現(xiàn)明顯高表達(dá)，然而的表達(dá)下降。

MMPs是一種鋅依賴性的中性蛋白酶家族，便于細(xì)胞在基質(zhì)中的遷移，參與組織重塑，對(duì)疙瘩形成過程中細(xì)胞外基質(zhì)的合成及降解的調(diào)控有重要作用，維持細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡，參與人體許多病理及生理過程[16-17]。在瘢痕的形成過程中，MMPs起著十分重要的作用，特別是MMP-1、MMP-2和MMP-9等，是影響膠原降解的主要因素[18]。MMP-1和MMP-2在瘢痕的形成過程中被成纖維細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)，以降解細(xì)胞外基質(zhì)，便于細(xì)胞在基質(zhì)中的遷移，參與組織重塑[19-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，瘢痕成纖維細(xì)胞在BTX-A作用下，MMP-1與MMP-2明顯高表達(dá)，然而MMP-9表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，推測(cè)BTX-A作用下瘢痕成纖維細(xì)胞通過降低TGF-β的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)MMP-1及MMP-2的表達(dá)來增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，進(jìn)而降低瘢痕成纖維細(xì)胞膠原過度沉積的問題，對(duì)瘢痕疙瘩等的預(yù)防起到積極的作用。

綜上所述，BTX-A通過降低瘢痕成纖維細(xì)胞細(xì)胞骨架牽張力，抑制TGF-β的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)MMP-1與MMP-2的表達(dá)增強(qiáng)瘢痕組織細(xì)胞胞外基質(zhì)及組織的重塑，從而對(duì)瘢痕的預(yù)防及治療起著積極的作用。但本研究?jī)H對(duì)MMPs等分子進(jìn)行了初步研究，TGF-β是如何對(duì)MMP-1與MMP-2調(diào)控，以及是否還有其他分子參與該過程還有待進(jìn)一步研究。

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ApreliminarystudyonthemechanismofbotulinumtoxintypeAinpreventingtheproliferationofkeloidfibroblastcells*

HaoRongtao,LiZongchao,ChenXing,YeWei△

(DepartmentofSkinCosmetology,TraditionalChineseMedicineHospitalofChongqingCity,Chongqing400037,China)

ObjectiveTo investigate the effects of different concentrations of botulinum toxin type A on hypertrophic scar fibroblasts,and to explore the molecular mechanism of botulinum toxin type A in the treatment of scar and prevention of postoperative scar hyperplasia.MethodsDifferent concentrations of botulinum toxin A(0.01,0.1,1 U/L and 10 U/L) were used on hypertrophic scar fibroblasts for 24 hours,to observe the changes of cell adhesion and cytoskeleton under laser confocal microscopy.MTT and flow cytometry were used to detect the proliferation,apoptosis and cycle of change,at the same time real time fluorescence quantitative PCR and Western blot were conducted to detected the expression of TGF-β,matrix metalloproteinase MMP-1,MMP-2 and MMP-9 gene and protein expression changes.ResultsWith the increase of botulinum toxin A dose,the number of cell adhesion and cytoskeletal fluorescence intensity decreased,cell proliferation ability decreased and mainly blocked at G0-G1phase,and the apoptosis also increased with the dose increased.The results of qPCR and Western blot showed that MMP-1 and MMP-9 gene and protein were highly expressed with the increase of botulinum toxin A dose,while TGF-β and MMP-9 showed low expression.ConclusionBotulinum toxin A can inhibit the proliferation of hypertrophic scar fibroblasts and inhibit the expression of MMP-1 and MMP-2,which can inhibit scar formation.It plays a positive role in the treatment of scar.

] botulinum toxin type A;keloid;fibroblast;molecular mechanism

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.36.016

重慶市衛(wèi)計(jì)委醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目(20142071)。

郝榮濤(1982-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事瘢痕防治的臨床及科研工作?！?/p>

，E-mail:cqzyyyw@sina.com。

R622

A

1671-8348(2017)36-5086-04

2017-08-22

2017-09-24)