自噬調(diào)控因子mTOR和Beclin1在良惡性多形性腺瘤中的表達及意義*

李 磊，李 冉，劉 江，劉 銳，楊國海，張艷波△

(1.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院口腔科,河北承德 067000；2.華北理工大學組織學與胚胎學系,河北唐山 063000;

3.河北省唐山市工人醫(yī)院口腔科 063000；4.華北理工大學解剖學系，河北唐山 063000)

論著·臨床研究

自噬調(diào)控因子mTOR和Beclin1在良惡性多形性腺瘤中的表達及意義*

李 磊1，李 冉2，劉 江3，劉 銳1，楊國海4，張艷波1△

(1.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院口腔科,河北承德 067000；2.華北理工大學組織學與胚胎學系,河北唐山 063000;

3.河北省唐山市工人醫(yī)院口腔科 063000；4.華北理工大學解剖學系，河北唐山 063000)

目的研究自噬調(diào)控中的主要因子西羅莫司靶蛋白(mTOR)及Beclin1在良、惡性多形性腺瘤中的表達及意義。方法采用免疫組織化學顯色檢測Beclin1在35例腮腺瘤多形性腺瘤(CPA)，37例腮腺良性多形性腺瘤(PA)和20例正常腮腺組織中的表達情況。用蛋白免疫印跡法(Western blot)測定p-mTOR 、Beclin1在CPA、PA及正常腮腺組織中的表達情況。結(jié)果p-mTOR 在正常腮腺組織，PA，CPA中的陽性表達呈遞增的趨勢，三者間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Beclin1在3種組織中表達呈遞減趨勢,三者間差異也有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論mTOR信號因子在CPA組織中過度表達，而Beclin1在CPA組織中的陽性表達受到抑制。

自噬;他克莫司結(jié)合蛋白質(zhì)類;Beclin 1；癌在多形性腺瘤

多形性腺瘤(pleomorphic adenoma，PA)又名混合瘤，多發(fā)生于腮腺，手術(shù)切除后常容易復發(fā)，生長一段時期后，突然加速生長，多為惡變。目前研究顯示，腫瘤的發(fā)生常伴隨著細胞自噬活性的改變，其調(diào)控機制及自噬通路相關(guān)蛋白在良、惡性腫瘤，如癌在多形性腺瘤(carcinoma in pleomorphic adenoma，CPA)中的作用尚不清楚，本課題將進一步研究自噬相關(guān)因子在良、惡性腫瘤中的作用。

西羅莫司靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)和Beclin1都有介導自噬發(fā)生的作用，并形成mTOR-Beclin1交互調(diào)控網(wǎng)絡，調(diào)節(jié)自噬。有研究證明 PI3K-Akt/TSC1/2-mTOR 信號通路在腫瘤的生成生長中起重要作用，在肝癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌等均有報道[1-2]。本研究通過對PI3K/Akt-TSC1/2-mTOR信號通路相關(guān)蛋白磷酸化mTOR(p-mTOR)及自噬相關(guān)蛋白Beclin1表達的檢測，分析其與腮腺良、惡性腫瘤的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1材料與試劑 所用組織來源于唐山市工人醫(yī)院和承德附屬醫(yī)院口腔外科手術(shù)病理組織，其中CPA組織35例， 腮腺組織37 例，正常腮腺組織20例。所有手術(shù)標本有2名醫(yī)師進行病理驗證，且患者術(shù)前未進行放療、化療等治療。p-mTOR、Beclin 1單克隆抗體均購自Santa Cruz公司。

1.2免疫組織化學檢測 石蠟切片按常規(guī)脫蠟置水，3%過氧化氫孵育10 min(室溫下)，清洗后加正常山羊血清于切片封閉，室溫孵育10 min滴加1∶400一抗工作液，37 ℃ 孵育 1～2 h，切片加生物素標記的二抗工作液，室溫孵育15～30 min后滴加適量辣根過氧化物酶工作液孵育。切片滴加DAB顯色，組織細胞著棕黃色后終止反應，以蘇木素復染、分色，切片脫水透明后封片。陰性對照組不加一抗以PBS替代。

1.3Western blot法半定量分析Beclin1、p-mTOR表達情況 4 ℃預冷的細胞裂解液裂解保存的組織，冰浴中用勻漿器將組織勻漿， 4 ℃ 30 min后提取上清液，以微孔酶標儀法進行蛋白定量，樣品處理后加樣，轉(zhuǎn)膜并加抗靶蛋白的特異性一抗，以牛血清清蛋白(BSA)溶液稀釋，其中Beclin1稀釋比例1∶500，p-mTOR稀釋比例1∶1 000，加針對一抗的堿性磷酸酶偶聯(lián)二抗于室溫下孵育，經(jīng)自動圖像分析系統(tǒng)半定量分析實驗結(jié)果。應用Image J醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)在同一條件下測定目標條帶整合光密度值，計算出各組樣品目標條帶與內(nèi)參(β-actin)比值大小作為分析對象進行比較。

A:正常腮腺;B:PA;C:CPA

圖1 Beclin1在各組織中的表達(免疫組織化學×400)

1.4免疫組織化學結(jié)果評價 將細胞質(zhì)內(nèi)染色為棕黃色顆粒標記為陽性細胞。由2名病理科醫(yī)師觀察10個高倍視野，采用雙盲法閱片，以每個視野100個細胞計數(shù)，以陽性細胞率和陽性細胞染色深度進行細胞陽性率評定。陽性細胞率：1分，陽性細胞數(shù)比率占細胞總數(shù)小于10%；2分，陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)10%～50%；3分，陽性細胞數(shù)占細胞總數(shù)大于50%。染色深度：0分為無染色標記；1分為淡黃色標記，2分為黃色標記，3分為棕黃色標記。2項評分相乘即為總評分，陰性0～3分，陽性4分及以上。結(jié)果定量：免疫組織化學陽性分析經(jīng)自動圖像分析系統(tǒng)進行半定量。

2 結(jié) 果

2.1Beclin1在正常、PA、CPA腮腺組織中的表達 Beclin1在正常、PA、CPA腮腺組織中的陽性率分別為100%、89%、56%(圖1)，三者間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

A：Western blot；B：Western blot分析圖；a:P<0.05比較，與正常腮腺組織;b:P<0.05，與PA組腮腺組織比較

圖2 p-mTOR在正常、PA和

CPA腮腺組織中的表達

2.2Western blot法檢測p-mTOR、Beclin1在各組織中的表達結(jié)果 p-mTOR在3種腮腺組織中均有表達，其表達量在正常、PA、CPA腮腺組織中呈遞增趨勢，三者之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。Beclin1在正常、PA、CPA、腮腺組織中的表達呈遞減趨勢，三者之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

A：Western blot；B：Westerh blot分析圖；a:P<0.05，與正常腮腺組織比較;b:P<0.05，與PA比較

圖3 Beclin1在正常、PA和CPA腮腺組織中的表達

3 討 論

自噬是真核細胞特有的生命現(xiàn)象，是亞細胞水平變化的一種進化保守的細胞功能。在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中都存在細胞自噬及信號轉(zhuǎn)導的改變。本課題組前期研究顯示，自噬相關(guān)蛋白LC3在腮腺PA及CPA中表達下調(diào)，提示自噬功能改變可能在腮腺腫瘤形成中具有一定作用[3]。mTOR和Beclin1是自噬調(diào)控的重要因子，在Beclin1調(diào)節(jié)自噬的網(wǎng)絡功能中mTOR細胞信號傳導通道的作用及之間存在的相互反饋調(diào)控機制的研究也是當今熱點問題之一[4]。

mTOR屬于磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶蛋白家族成員，是細胞調(diào)節(jié)的主要激酶。調(diào)控著大量促進細胞周期進程的蛋白質(zhì)的翻譯，異常的mTOR活性與大量的人類癌癥有著密切的關(guān)系。mTOR在自噬的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要調(diào)控作用，是自噬調(diào)控通路上的關(guān)鍵位點。mTOR作為下游信號分子，可以直接被AKT激活，也可以通過抑制TSC來激活。Johnson等[5]在對直結(jié)腸癌的分析研究中顯示p-mTOR的表達明顯高于正常黏膜組織。Guo等[6]對患有腎囊腺瘤的小鼠使用西羅莫司進行治療，4周后測量腫瘤體積顯著減小，同時發(fā)現(xiàn)mTOR的表達量下降，這顯示mTOR在腎囊腺瘤的發(fā)展中起到了重要的作用。本試驗探討了mTOR信號通路在腮腺CPA、正常腮腺組織、良性PA中的表達情況，發(fā)現(xiàn)p-mTOR在大部分腮腺PA中呈過度表達。p-mTOR在正常腮腺組織、良性PA、CPA中的陽性表達呈遞增趨勢，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示mTOR信號通路在腮腺CPA組織中表達異常，可能在腮腺CPA的發(fā)生、發(fā)展中起到了重要的作用。

Beclin1基因是人們在研究致死Sinbis病毒性腦炎大鼠過程中，在其中分離出的一個與腫瘤抑制相關(guān)的基因[7]，Beclin1蛋白由4個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成：卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域、BH3、進化保守結(jié)構(gòu)域和核輸出結(jié)構(gòu)域[8]，通過這些結(jié)構(gòu)域形成復合體定位于自噬體膜上從而介導自噬，誘導細胞凋亡。Beclin1復合體與含有BH3結(jié)構(gòu)域的Bcl-2結(jié)合后可改變細胞自噬進程，并且Beclin1與Bcl-2的作用受環(huán)境影響較大，當環(huán)境養(yǎng)分減少時自噬基因Beclin1和Bcl-2之間的相互作用顯著減少。研究發(fā)現(xiàn)在子宮頸癌[9]、結(jié)腸癌、卵巢癌[10]等多種腫瘤中都發(fā)現(xiàn)表達異常的Beclin1蛋白。本試驗用Western blot法測定Beclin1在35例CPA、37例PA和20例正常腮腺組織中的表達情況，結(jié)果顯示在正常腮腺組織Beclin1有較高水平表達，在PA中表達較低，在CPA中表達最低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示Beclin1的表達降低可能與CPA的形成及病理進程密切相關(guān)，可作為判斷惡性多形性腺瘤的預后的輔助指標，同時有望成為其生物治療的新靶點。

自噬調(diào)控因子mTOR和Beclin1是介導調(diào)控自噬的重要因子，在細胞自噬中扮演重要角色，其在腫瘤中的表達異常可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要意義，其分子學機制還有待進一步研究。

[1]Huang GM,Jiang QH,Cai C,et al.SCD1 negatively regulates autophagy-induced cell death in human hepatocellular carcinoma through inactivation of the AMPK signaling pathway[J].Cancer Lett,2015,358(2)；180-190.

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[3]李冉，李磊，劉江，等.Beclin 1 與LC3 蛋白在腮腺多形性腺瘤及腮腺癌在多形性腺瘤中的表達和意義[J].第三軍醫(yī)大學學報，2012,34(13)：1293-1295.

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ExpressionandsignificanceofautophagicregulatoryfactormTORandBeclin1inbenignandmalignantpleomorphicadenoma*

LiLei1,LiRan2,LiuJiang3,LiuRui1,YangGuohai4，ZhangYanbo1△

(1.DepartmentofStomatology,AffiliatedStomatologyHospitalofChengdeMedicalCollege,Chengde,Hebei067000,China2.FacultyofHistologyandEmbryology，NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan,Hebei063000,China；3.DepartmentofStomatology，Workers′HospitalofTangshanCity,Hebei067000,China；4.FacultyofAnatomy,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan,Hebei063000,China)

ObjectiveTo explore the expression and significance of main autophagic regulatory factors of mTOR and Beclin1 in benign and malignant pleomorphic adenoma.MethodsThe expression of Beclin1 in 35 cases of carcinoma in parotid pleomorphic adenoma(CPA),37 cases of benign pleomorphic adenoma(PA) and 20 cases and normal parotid tissues was measured by adopting the immunohistochemical staining method.The expression of p-mTOR and Beclin1 in CPA,PA and normal parotid tissues was measured by Western blot.ResultsThe positive expression of p-mTOR in normal parotid tissue,parotid pleomorphic adenoma and parotid pleomorphic adenoma showed the increasing trend,and the difference among them was statistically significant(P<0.05).The Beclin1 level in 3 kinds of tissue showed the descending trend,the difference among the three tissues was statistically significant(P<0.05).ConclusionmTOR signal factor is over-expressed in CPA tissue,while the positive expression of Beclin 1 is inhibited in CPA tissue.

] autophagy;tacrolimus binding proteins;Beclin 1;carcinoma in pleomorphic adenoma

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.36.015

河北省重點科技研究計劃(20130338，20150079)；河北省自然科學基金資助項目(H2014105079)。

李磊(1978-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事口腔臨床研究?！?/p>

，E-mail:13831476354@163.com。

R739.87

A

1671-8348(2017)36-5083-03

2017-08-09

2017-09-11)