‘小金海棠’多酚對高脂小鼠肝組織的影響

王 鵬，韋月平

（遼東學院農(nóng)學院，丹東 118003）

‘小金海棠’多酚對高脂小鼠肝組織的影響

王 鵬，韋月平

（遼東學院農(nóng)學院，丹東 118003）

采用飼喂高脂飼料建立高脂小鼠模型，‘小金海棠’多酚（MXP）灌胃給藥（50 mg/kg、100 mg/kg）連續(xù)7周檢測肝組織中甘油三酯（TG）與總膽固醇（TC）水平，并觀察肝組織形態(tài)，最后檢測糖脂代謝途徑相關蛋白（IRS、Akt）的表達狀況。結果表明：MXP可以降低肝組織中TG和TC水平，并能明顯抑制肝細胞損傷，其中100 mg/kg組效果較好；更為重要的是MXP可以顯著提高IR和IRS的表達，改善糖脂代謝信號通路。

小金海棠；多酚；高脂

‘小金海棠’（Malus xiaojinensis）是中國自主篩選出的第一個抗缺鐵黃葉病的蘋果品種，已在國內廣泛種植［1］。其果實含豐富的營養(yǎng)成分，特別是多酚類物質可達0.9%左右，包括蘆丁、原兒茶酸以及少量對香豆酸和阿魏酸等［2］。研究顯示，植物多酚類物質具有超強的抗氧化活性和自由基清除能力，在降血糖、降血脂、保護心腦血管、護肝、抗癌等方面有一定的作用［3-6］。國內外已經(jīng)開展了很多有關植物多酚的提取研究，但對于‘小金海棠’提取物活性及功能的研究少見。本試驗根據(jù)‘小金海棠’多酚的藥理作用特性，研究其對高脂飲食誘導小鼠肝組織的影響，并對其機制進行探討，以期為其作為功能性保健品開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5周齡SPF級雄性KM小鼠，購于遼寧長生生物技術有限公司。

‘小金海棠’多酚（Malus xiaojinensis Polyphenols，MXP）采用乙醇提取，大孔樹脂純化，純度＞90%。

甘油三酯（TG）檢測試劑盒、總膽固醇（TC）檢測試劑盒及總RNA提取試劑盒購自南京建成生物工程研究所；First Strand cDNA Synthesis Kit及All-in-OneTMqPCRMix購自上海索萊寶生物科技有限公司；蘇木素伊紅染色試劑盒（HE試劑盒）購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

5430 R型臺式冷凍離心機，德國 Eppendorf；DK-S22型電熱恒溫水鍋 Electric Water Bath；Infinite F200/M200型酶標儀，TECAN公司；ABI 7500定量PCR儀，美國應用生物系統(tǒng)公司；組織切片機，德國Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 動物處理

小鼠經(jīng)1周適應期后，隨機分成試驗組與對照組。對照組飼喂正常飼料（NFD），試驗組飼喂高脂飼料（HFD）。試驗組分為3個小組，小鼠每天分別進行相應的灌胃處理，即HFD組（生理鹽水）、低劑量組（HFD+50 mg/kg MXP）和高劑量組（HFD+100 mg/kg MXP）。每周定時稱量小鼠體重一次，并觀察其活動及精神狀態(tài)，7周后，眼球采血，處死后摘取肝臟［7］。飼料成分如表1。

表1 正常飲食和高脂飲食配方Table 1 The formula of normal diet and high-fat diet %

1.3.2 肝組織TG與TC水平檢測

取肝組織1 g，加入9mL生理鹽水，制成勻漿。按照試劑盒操作方法測定肝組織TG（甘油三酯）與TC（總膽固醇）含量。

1.3.3 HE染色

取小鼠肝臟用福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋切片，切片常規(guī)用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級乙醇至水洗，蘇木素染色5 min，自來水沖洗，鹽酸乙醇分化30 s，自來水浸泡15 min，置伊紅液2 min，常規(guī)脫水、透明、封片，用顯微鏡觀察并拍照。

1.3.4 Western Blotting免疫印跡法［8］

定量稱取肝組織于小管中剪碎，加入細胞裂解液于冰上裂解30 min，于4℃、13 500 r/min離心15 min，上清液即為肝組織總蛋白。12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后將其轉移到硝酸纖維素膜上，并用以下抗體進行免疫印跡：anti-IRS、anti-Akt及 anti-β-actin（Bio Basic Inc.，加拿大）。

1.3.5 統(tǒng)計分析

試驗結果采用平均值±標準差格式。采用SPSS軟件進行單因素方差分析，P＜0.05為5%差異顯著，P＜0.01為1%差異顯著，P＜0.001為1‰差異顯著。

2 結果與分析

2.1 ‘小金海棠’多酚（MXP）對小鼠肝脂指標的影響

如圖1所示，肝組織中TG與TC含量為試驗組（HFD+MXP）低于對照組（NFD）。隨著MXP的加入，TG與TC含量呈下降趨勢，且隨著劑量的增加效果越明顯，其中100 mg/L MXP組小鼠肝中TG水平顯著（P＜0.001）低于NFD組。

2.2 ‘小金海棠’多酚（MXP）對小鼠肝臟中炎癥因子表達的影響

肝組織病理學觀察是評價肝組織形態(tài)和組織學的重要指標。如圖2所示，顯微鏡下（16×40倍）觀察到對照組小鼠的肝組織結構排列整齊，中心靜脈的大小正常，肝細胞形態(tài)清晰，膜完整。長期高脂飲食（HFD）則造成大量肝細胞脂肪累積變性和炎性細胞浸潤，細胞排列層次紊亂且細胞膜受到損壞。MXP（50 mg/kg、100 mg/kg）補充明顯逆轉了上述高脂飲食導致的不利變化，且100 mg/kg劑量的效果更佳。

圖1 ‘小金海棠’多酚（MXP）對小鼠肝組織中TG與TC水平的影響Fig.1 Effect of MXP on the level of TG and TC in liver tissues ofm ice

圖2 小金海棠多酚（MXP）對小鼠肝組織病理的影響Fig.2 Effect of MXP on liver pathology in m ice

2.3 ‘小金海棠’多酚（MXP）對小鼠糖脂代謝通路相關蛋白表達的影響

胰島素受體底物（IRS）與蛋白激酶B（Akt）是體內能量代謝的關鍵蛋白，直接調控著細胞對葡萄糖的吸收和利用，間接調控著脂肪的代謝［9-10］。以β-actin內參抗體作為Western Blotting內部參照指數(shù)。如圖3所示，對照組（NFD）的IRS與Akt表達量明顯高于高脂飲食組（HFD），在經(jīng)過7周的MXP灌胃后，二者在HFD組的表達量明顯得到提升。試驗結果顯示，MXP能明顯改善糖脂代謝信號通路。

圖3 ‘小金海棠’多酚（MXP）對小鼠肝組織糖脂代謝通路相關蛋白表達的影響Fig.3 Effect of MXP on the glycolipid metabolic pathway related protein in liver tissue ofm ice

3 結論

本試驗在對小鼠進行高脂飼料飼喂的同時，又對其進行MXP灌胃7周，相比于只進行高脂飼料飼喂的小鼠，肝組織中TG、TC水平明顯下降，可能正是因為MXP可以降低肝組織中TG的水平，從而降低了血脂水平。顯微鏡觀察結果表明，MXP處理還能顯著降低高脂飲食引起的肝組織炎癥水平升高，肝臟作為機體的主要代謝器官，其炎性細胞因子的過度累積會造成肝細胞損傷引起代謝功能障礙，從而導致脂肪過度生成［11-13］。試驗表明，‘小金海棠’多酚能降低肝臟的炎癥水平，改善肝細胞的生存微環(huán)境，從而起到護肝的作用，進而調節(jié)血脂平衡，許多國內外學者的研究也證實了這點［14-15］。IRS與Akt是糖脂代謝信號通路的關鍵蛋白，研究表明肝臟中缺失IRS與Akt會造成胰島素耐受，并會喪失對高糖高脂飲食的反應，使肝臟“認為”機體處于禁食狀態(tài)，作為響應，肝臟會繼續(xù)生成葡萄糖從而為細胞持續(xù)供給富能分子，致使脂質過度積累［16-18］。MXP對于這種狀況有著良好的改善作用，可為解決胰島素耐受提供新的思路。

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Effects of Malus xiaojinensis polyphenols on high fat liver tissue ofmouse

WANG Peng，WEIYue-ping

（Agricultural College，Eastern Liaoning University，Dandong118003，China）

Hyperlipemia mice model was established by feeding high-fat diet and MXP gavage administration（50 mg/kg and 100 mg/kg）were treated tomice for 7 weeks.The levels of triglyceride（TG）and total cholesterol（TC）in liver tissue were detected，and themorphology of liver tissueswas observed.Finally，the expression of related proteins（IRS，Akt）in the pathway of glucose and lipidmetabolism was detected.The results showed that MXP could reduce the level of TG and TC in liver tissue and inhibit the injury of liver cells obviously.The effect of 100 mg/kg group was better.More importantly，MXP could significantly improve the expression of IR and IRS and improve the signaling pathway of glycolipid metabolism.

Malus xiaojinensis；Polyphenols；Hyperlipidemia

2016-06-21

遼東學院青年基金項目（2016QN029）“小金海棠多酚對肝臟功能的改善及機制研究”

王鵬（1970—），男，碩士，副教授，研究方向：植物次生物提取。E-mail：58993698＠qq.com，Tel：18242588906 13342171866

R282.71

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1000-3924（2017）06-053-04

閆其濤）