干擾素誘導跨膜蛋白3在結腸癌組織中的表達及對結腸癌細胞凋亡的調控作用研究

卞俊杰，李醒亞，郭偉華，田國防，貴永賢，呂振選

（1.河南省新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院 腫瘤內科，河南 新鄉(xiāng) 453000；2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院 腫瘤科，河南 鄭州 450052）

干擾素誘導跨膜蛋白3在結腸癌組織中的表達及對結腸癌細胞凋亡的調控作用研究

卞俊杰1，李醒亞2，郭偉華1，田國防1，貴永賢1，呂振選1

（1.河南省新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院 腫瘤內科，河南 新鄉(xiāng) 453000；2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院 腫瘤科，河南 鄭州 450052）

目的探討干擾素誘導跨膜蛋白3（IFITM 3）在結腸癌組織中的表達及對結腸癌細胞凋亡的調控作用。方法實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測結腸癌組織和對應的癌旁組織中IFITM 3的表達水平。細胞轉染si-IFITM 3抑制IFITM 3的表達，同時轉染si-control作為對照，MTT檢測轉染后48 h的細胞增殖情況。流式細胞術檢測細胞凋亡情況。Western blot檢測細胞中Bcl-2、Bax、p-STAT3、STAT3蛋白表達水平。結果IFITM 3在結腸癌組織中的表達水平高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。si-IFITM 3組結腸癌細胞HT29和HCT116的存活率與si-control組相比下降，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。轉染si-IFITM 3后的結腸癌細胞HT29和HCT116凋亡率高于si-control組，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。轉染si-IFITM 3后的結腸癌細胞HT29和HCT116中STAT3蛋白表達水平?jīng)]有變化，p-STAT3、Bcl-2蛋白表達水平低于si-control組，Bax蛋白表達水平高于si-control組。結論干擾素誘導跨膜蛋白3在結腸癌組織中過度表達。抑制干擾素誘導跨膜蛋白3的表達，可以抑制結腸癌細胞的增殖，促進癌細胞凋亡，其作用機制與Bcl-2、Bax、STAT3有關。

結腸癌；干擾素誘導跨膜蛋白3；凋亡；增殖

結腸癌是一種常見的發(fā)生于消化道的惡性腫瘤，其發(fā)病率在所有胃腸道惡性腫瘤中位居第2位[1]。結腸癌多發(fā)生于40歲以后的人群，其中男性的發(fā)病率為女性發(fā)病率的2倍[2]。在中國，結腸癌每年死亡人數(shù)在全部惡性腫瘤中位居第5位[3]。環(huán)境、生活方式、飲食習慣等多種因素都可引發(fā)結腸癌。結腸癌嚴重威脅著人類的生命健康。

干擾素誘導跨膜蛋白（interferon-induced transmembrance，IFITM）廣泛存在于不同種屬的細胞內。IFITM 3具有廣泛的抗病毒作用[4]。近年來研究表明，IFITM在乳腺癌組織中高表達，沉默IFITM 3基因的表達后，乳腺癌細胞增殖能力明顯降低[5]。本研究通過實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）法檢測IFITM 3基因在結腸癌組織中的表達水平，探討IFITM 3基因對結腸癌細胞的增殖凋亡作用，以期為進一步研究結腸癌的發(fā)病機制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 細胞及組織 人結腸癌細胞HT29和HCT116購自于中國科學院細胞庫。人結腸癌組織及正常的癌旁組織各50例來自2011年1月-2014年6月在新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院確診治療的結腸癌患者。

1.1.2 主要試劑及儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青鏈霉素均購自于美國Sigma公司，BCA蛋白濃度檢測試劑盒、逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、MTT、Trizol細胞裂解液、Annexin V-FITC、PI、Loading buffer、PVDF膜、DMSO溶液均購自于北京鼎國生物試劑有限公司，Bcl-2多克隆抗體、Bax多克隆抗體、p-STAT3多克隆抗體、STAT3多克隆抗體、GAPDH單克隆抗體、辣根過氧化物標記的二抗均購自于杭州聯(lián)科生物科技有限公司，流式細胞儀購于美國Thermo公司，紫外分光光度計購自于上海精密儀器表公司，二氧化碳CO2培養(yǎng)箱購自日本三洋公司。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR檢測IFITM 3在結腸癌組織中的表達 收集的50例結腸癌組織和正常的癌旁組織剪碎后，加入適量的Trizol細胞裂解液，充分混合后，放置于室溫下裂解5 min。在裂解液中加入氯仿200μl，上下劇烈搖晃20次，放在室溫下靜置5 min。14 000 r/min，4℃離心15 min，用移液槍吸取上層水相層至新的EP管中，每個EP管中加入500μl的異丙醇后，放置于冰上靜置10 min。14 000 r/min，4℃離心15 min。收集RNA沉淀，用75%的乙醇洗滌后，放置于室溫條件下晾干，加入DEPC水溶解后，紫外分光光度計檢測提取的RNA濃度及純度。按照逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄合成IFITM 3的cDNA，qRT-PCR檢測IFITM 3表達水平。正向引物：5'-TGTCCAAACCTTCTTCTC-3'，反向引物：5'-CGTCG CCAACCATCTTCC-3'。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 培養(yǎng)人結腸癌細胞HT29和HCT116用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃，濕度為95%，5% CO2培養(yǎng)箱。觀察細胞融合度達到90%時，進行細胞傳代。細胞傳代用0.25%的胰蛋白酶消化細胞。

1.2.3 細胞轉染 培養(yǎng)至對數(shù)生長期的人結腸癌細胞HT29和HCT116，加入胰蛋白酶消化細胞后，1 000 r/min離心10 min后，加入細胞生長液調整細胞濃度為2×104個/ml，接種至6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔中加入2 ml細胞懸液。放置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細胞融合度為60%左右時，按照常規(guī)方法將IFITM 3抑制物（si-IFITM 3）轉染到結腸癌細胞中，同時轉染si-control作為對照。轉染后6 h更換為含有胎牛血清的細胞生長液，放置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.4 MTT檢測細胞增殖 取轉染后的結腸癌細胞，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，調整細胞濃度使每孔中細胞個數(shù)為2×103個。同時設置空白組，空白組中不加入細胞，加入等量的細胞生長液。每組設置7個復孔，以提高實驗準確性。培養(yǎng)48 h后，在細胞中加入5 mg/ml的MTT溶液，每孔加入20μl。放置于37℃繼續(xù)孵育4 h后，棄掉細胞培養(yǎng)液，在細胞中加入DMSO溶液，每孔中加入100μl。充分混合后，觀察結晶物完全融化后，用酶標儀檢測490 nm處每孔的吸光度，計算細胞的存活率。細胞存活率=（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集處于對數(shù)生長期的結腸癌細胞，加入細胞生長液，調整細胞濃度為1×106個/ml。取1 ml細胞懸浮液，1 000 r/min離心10 min后，加入提前預冷的PBS洗滌細胞2次。在細胞中加入Annexin V-FITC和PI各5μl后，充分混合，放置于室溫下孵育20 min。加入400μl的結合緩沖液，混合均勻后，用流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。

1.2.6 Western blot檢測細胞中Bcl-2、Bax、p-STAT3、STAT3表達水平 取處于對數(shù)生長期的結腸癌細胞，棄掉細胞生長液，在細胞中加入含有PMSF濃度為1%的RIPA裂解液裂解細胞，每個6 cm的細胞培養(yǎng)皿中加入200μl體積的細胞裂解液。放置于冰上充分裂解40 min，觀察細胞完全裂解后，12 000 r/min，4℃離心15 min。取上清液，用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測提取的蛋白濃度。將提取的蛋白樣品與5×Loading buffer充分混合后，放置于100℃水浴鍋中煮沸5 min。取50μl變性蛋白樣品加入到上樣孔中，蛋白凝膠用12%分離膠和5%濃縮膠。電泳初始電壓為80 V，終末電壓為120 V。電泳結束后，蛋白凝膠在4℃轉膜90 min，轉膜電壓為90 V。轉膜后，PVDF膜依次與一抗、二抗孵育反應后，在暗室中曝光，分析蛋白表達含量。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，計量資料采用單因素方差分析進行比較，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 IFITM 3在結腸癌組織中的表達

收集的50例結腸癌組織和正常的癌旁組織經(jīng)RNA提取，逆轉錄合成cDNA后，qRT-PCR檢測IFITM 3水平。結果顯示，IFITM 3在結腸癌組織中的表達水平高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學意義（t=6.371，P=0.001）。見圖 1。

2.2 細胞增殖結果

收集轉染si-IFITM 3和si-control后培養(yǎng)48 h的細胞，MTT檢測細胞增殖情況。結果顯示，轉染si-IFITM 3后，結腸癌細胞HT29和HCT116的存活率與si-control組相比下降，差異具有統(tǒng)計學意義（tHT29=6.438，PHT29=0.001；tHCT116=5.984，PHCT116=0.002）。見圖2。

2.3 細胞凋亡結果

圖1 IFITM 3在結腸癌組織和癌旁組織中的表達

圖2 IFITM 3對結腸癌細胞存活率的影響

收集轉染si-IFITM 3和si-control后培養(yǎng)48 h的細胞，經(jīng)Annexin V-FITC和PI雙染色后，流式細胞術檢測細胞凋亡情況。結果顯示，轉染si-IFITM 3后的結腸癌細胞HT29和HCT116凋亡率高于si-control組，差異具有統(tǒng)計學意義（tHT29=6.158，PHT29=0.002；tHCT116=8.967，PHCT116=0.000）。見圖 3。

2.4 細胞中 Bcl-2、Bax、p-STAT3、STAT3 表達結果

圖3 IFITM 3對結腸癌細胞凋亡率的影響

收集轉染si-IFITM 3和si-control后培養(yǎng)48 h的細胞，經(jīng)細胞總蛋白提取，Western blot檢測細胞中Bcl-2、Bax、p-STAT3、STAT3蛋白表達水平。結果如圖4顯示：與si-control組相比，si-IFITM 3組HT29-p-STAT3表達差異有統(tǒng)計學意義（t=8.897，P=0.000），與si-control組相比，si-IFITM 3組HT29-Bcl-2表達差異有統(tǒng)計學意義（t=8.217，P=0.001），與si-control組相比，si-IFITM 3組HT29-Bax表達差異有統(tǒng)計學意義（t=8.384，P=0.001）；與si-control組相比，si-IFITM 3組HCT116-p-STAT3表達差異有統(tǒng)計學意義（t=9.054，P=0.000），與 si-control組相比，si-IFITM 3組HCT116-Bcl-2表達差異有統(tǒng)計學意義（t=8.587，P=0.001），與si-control組相比，si-IFITM 3組HCT116-Bax表達差異有統(tǒng)計學意義（t=9.035，P=0.000）。轉染si-IFITM 3后的結腸癌細胞HT29和HCT116中STAT3蛋白表達水平?jīng)]有變化，p-STAT3、Bcl-2蛋白表達水平低于si-control組，Bax蛋白表達水平高于si-control組。

3 討論

結腸癌是一種常見的嚴重危害人類生命健康的疾病。結腸癌的發(fā)病率和死亡率極高，尤其是近年來隨著人們生活水平的不斷提高，結腸癌的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[6]。研究結腸癌的發(fā)病機制，對于治療和診斷結腸癌的發(fā)生具有重要意義。

IFITM 3是IFITM蛋白家族中的一員[7]。最早發(fā)現(xiàn)IFITM在抗病毒方面具有重要作用，對肝炎病毒、艾滋病病毒、巨細胞病毒等都具有防御作用。IFITM的抗腫瘤作用是近年來研究的熱點[8-9]。IFITM在宮頸癌、膠質瘤等頭頸部的腫瘤中過度表達[10-11]。幽門螺旋桿菌感染的浸潤癌以及胃癌前的病變中IFITM異常高表達[12]。IFITM 3在乳腺癌、肝癌中高表達，沉默IFITM 3后，肝癌細胞的侵襲遷移能力明顯降低[13-14]。本研究收集了50例結腸癌組織和相對應的癌旁組織，qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)IFITM 3在結腸癌組織中高表達，與癌旁組織相比差異具有統(tǒng)計學意義。轉染si-IFITM 3后，MTT檢測了轉染后48 h的細胞增殖情況發(fā)現(xiàn)，沉默IFITM 3表達可以抑制直腸癌細胞的增殖。

細胞凋亡的發(fā)生是一種正常的生物學現(xiàn)象[15]。在某些病理條件下，細胞增殖和凋亡不能維持正常的動態(tài)平衡，導致了癌癥的發(fā)生。細胞凋亡受多種基因的復雜調控。Bcl-2蛋白家族與細胞凋亡密切相關。Bcl-2和Bax均屬于Bcl-2蛋白家族中的成員，Bcl-2在細胞凋亡過程中發(fā)揮抑制作用，而Bax發(fā)揮促進作用[16]。信號轉導與轉錄活化因子STAT3是STAT家族中的一員，在STAT信號轉導通路中發(fā)揮重要作用[17]。STAT3參與乳腺癌、胃癌、前列腺癌、肝癌等多種癌細胞的生長發(fā)育[18-19]。STAT3在腫瘤中異?；罨?，是一種具有致癌作用的潛在因子[20]。本研究中，流式細胞儀檢測了結腸癌細胞沉默IFITM 3后的細胞凋亡情況，沉默IFITM 3后2種結腸癌細胞的凋亡率均升高。Western blot檢 測 Bcl-2、Bax、p-STAT3、STAT3蛋白表達變化，發(fā)現(xiàn)沉默IFITM 3后，結腸癌細胞中Bax蛋白表達升高，而Bcl-2、p-STAT3表達受到抑制。這提示，IFITM 3可以通過調控Bcl-2、Bax、p-STAT3表達影響結腸癌細胞的凋亡。

綜上所述，IFITM 3在結腸癌組織中高表達。沉默IFITM 3后，結腸癌細胞增殖受到抑制，細胞凋亡增加，其作用機制與Bcl-2、Bax、STAT3有關。這為進一步研究結腸癌的發(fā)病機制奠定了基礎，為診斷和治療結腸癌提供了新方向。

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Expression of IFITM3 in colon cancer tissue and its effect on apoptosis of colon cancer cells

Jun-jie Bian1, Xing-ya Li2, Wei-hua Guo1, Guo-fang Tian1, Yong-xian Gui1, Zhen-xuan Lü1
(1. Department of Medical Oncology, Xinxiang Central Hospital, Xinxiang, Henan 453000, China;2. Department of Oncology, the First Aff i liated Hospital, Zhengzhou University,Zhengzhou, Henan 450052, China)

ObjectiveTo investigate the expression of interferon-induced transmembrane 3 (IFITM3) in colon cancer tissues and its effect on the apoptosis of colon cancer cells.MethodsThe expression level of IFITM3 in colon cancer tissues and corresponding adjacent tissues was detected by qRT-PCR. Colon cancer cells were transfected with si-IFITM3, while si-control was used as a control. The proliferation of the transfected cells was detected by MTT.Cell apoptosis was detected by fl ow cytometry. Western blot was used to detect the expression levels of Bcl-2, Bax,p-STAT3 and STAT3 proteins in the cells.Results The expression level of IFITM3 in the colon carcinoma tissues was signi fi cantly higher than that in the adjacent tissues, and the difference was statistically signi fi cant (P＜ 0.05).The survival rates of colon cancer HT29 and HCT116 cells of the si-IFITM3 groups were signi fi cantly decreased compared with those of the si-control groups (P＜ 0.05). The apoptosis rates of colon cancer HT29 and HCT116 cells of the si-IFITM3 groups were signi fi cantly higher than those of the si-control groups, and the differences were statistically signi fi cant (P＜ 0.05). The expression levels of STAT3 in the si-IFITM3-transfected HT29 and HCT116 cells did not change compared with those in the si-control groups, but the expressions of p-STAT3 and Bcl-2 protein were significantly lower than those in the si-control groups, and Bax protein expression levels were significantly higher than those in the si-control groups.ConclusionsIFITM3 is over-expressed in colon cancer tissues. Inhibition of IFITM3 expression can inhibit the proliferation of colon cancer cells and promote the apoptosis of the cancer cells,its mechanism is related to Bcl-2, Bax and STAT3.

colon cancer; IFITM3; apoptosis; proliferation

10.3969/j.issn.1005-8982.2018.01.009

1005-8982（2018）01-0044-06

2017-02-13

R735.3

A

（張西倩 編輯）