結(jié)腸癌血清microRNA表達(dá)譜的檢測及臨床應(yīng)用價(jià)值*

王亞南，陳昭華，陳衛(wèi)昌

[1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇 蘇州 215006；2.蘇州市立醫(yī)院(南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院)，江蘇 蘇州 215002]

臨床研究·論著

結(jié)腸癌血清microRNA表達(dá)譜的檢測及臨床應(yīng)用價(jià)值*

王亞南1，陳昭華2，陳衛(wèi)昌1

[1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇 蘇州 215006；2.蘇州市立醫(yī)院(南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院)，江蘇 蘇州 215002]

目的找尋潛在的新型的結(jié)腸癌血清microRNA（miRNA）表達(dá)譜，探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。方法miRNA微陣列芯片技術(shù)檢測結(jié)腸癌患者和正常人血清中miRNA表達(dá)的差異，并對有差異表達(dá)的miRNA在60例結(jié)腸癌患者血清和60例正常對照組血清中的表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）驗(yàn)證。結(jié)果①芯片雜交結(jié)果中共有87種miRNAs在結(jié)腸癌患者血清和正常人血清標(biāo)本中有差異表達(dá)，其中上調(diào)表達(dá)有39個，下調(diào)表達(dá)有48個。②qRT-PCR對miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證，其中miR-31、miR-141、miR-224-3p、miR-576-5p和miR-4669這5個miR分子在結(jié)腸癌癥患者中的表達(dá)相對于正常對照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。③miR-31、miR-141、miR-224-3p、miR-576-5p和miR-4669這5個miR分子組成的miR-表達(dá)譜診斷結(jié)腸癌的效率較高（ROC曲線下面積為0.992）。結(jié)論臨床檢測結(jié)腸癌患者miR-31、miR-141、miR-224-3p、miR-576-5p和miR-4669循環(huán)分子標(biāo)志物表達(dá)譜有助于診斷結(jié)腸癌，有望成為結(jié)腸癌患者臨床診療評估的重要指標(biāo)。

結(jié)腸癌；血清microRNA；miRNA

結(jié)腸癌（colon cancer）的發(fā)生發(fā)展受多種因素的影響，是個多基因相關(guān)、多步驟的復(fù)雜過程。microRNA（miRNA）是一種長度為19～24個核苷酸，進(jìn)化上高度保守的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA，廣泛存在于動植物中。自1993年LEE等[1]在秀麗隱桿線蟲研究中發(fā)現(xiàn)了第一個miRNA-let4以來，截至2011年miRbase已收錄140個物種的15 000條miRNAs基因位點(diǎn)和17 000條不同的miRNAs序列[2]。目前有關(guān)研究[3-6]表明，miRNA的異常表達(dá)與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系。本技術(shù)利用miRNA微陣列芯片技術(shù)檢測結(jié)腸癌患者血清和正常人血清中miRNA表達(dá)的差異，并對有差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）驗(yàn)證，以找尋潛在的新型的結(jié)腸癌血清miRNA表達(dá)譜。

1 資料與方法

1.1 研究對象

芯片篩選miRANs標(biāo)本來源，收集蘇州市立醫(yī)院住院的結(jié)腸癌患者血清樣本3例，其中，男性1例，女性2例，且其均未接受任何手術(shù)治療、放療或者化療，但均經(jīng)病理學(xué)檢查確診。組織病理類型的判斷參照WHO病理分期。3例健康對照血清來自醫(yī)院體檢者。收集蘇州市立醫(yī)院住院的結(jié)腸癌患者血清樣本60例，其中，男性30例，女性30例，且其均未接受任何手術(shù)治療、放療或者化療，但均經(jīng)病理學(xué)檢查確診。組織病理類型的判斷參照WHO病理分期。60例健康對照血清來自醫(yī)院體檢者。具體資料見表1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血清標(biāo)本處理 在結(jié)直腸癌患者術(shù)前、結(jié)腸息肉患者術(shù)前和正常人體檢時(shí)用一次性真空采血管采集空腹靜脈血5 ml，3 000 r/min，離心5 min，分離血清，取1 ml血清離心后于-80℃保存。

1.2.2 miRNA芯片檢測 3例結(jié)腸癌患者血清和3例正常人血清標(biāo)本送至中國科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所進(jìn)行miRNA UniTag?微陣列芯片（無標(biāo)記miRNA芯片分析方法）檢測[7]。結(jié)果經(jīng)過數(shù)據(jù)分析，根據(jù)改變倍數(shù)≥1.5且P＜0.05篩選與正常人血清相比在結(jié)腸癌患者中有差異表達(dá)的miRNA。

表1 結(jié)腸癌患者臨床資料

1.2.3qRT-PCR檢測miRNA的表達(dá) 血清RNA抽提，吸取血清250μl與Trizol 750μl于2 ml離心管中，充分震蕩混勻。按說明書操作進(jìn)行RNA提取。紫外分光光度儀測定總RNA的吸光度（A260/280 nm）比值，取比值在1.8～2.2的標(biāo)本用于后續(xù)試驗(yàn)。miRNA3'末端加Poly（A）處理及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒說明書（天根公司）操作進(jìn)行。qRT-PCR按照miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒說明書（天根公司）操作?？偡磻?yīng)體系為20μl，包括2×miRcute miRNA Premix（含SYBR、ROX）10μl，10μmol/L正向、反向引物各0.4μl，miRNA 第一鏈 cDNA 2μl，50×ROX 參比染料1.6μl，ddH2O 5.6μl。循環(huán)參數(shù) ：94℃預(yù)變性 2 min，94℃ 20 s，60℃ 34 s，共43個循環(huán)。以miR-16作為內(nèi)參照[8]，對目標(biāo)基因進(jìn)行歸一化處理，確保以相等數(shù)量的樣品比較目標(biāo)基因的量。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個復(fù)孔。結(jié)果用2－△△Ct法[9]計(jì)算。取10μl qRT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用30 g/L瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果用百瑞凝膠成像儀觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)法對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，因數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距，組間數(shù)據(jù)比較采用Wilcoxon檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以手術(shù)切除的結(jié)腸癌組織病理報(bào)告為金標(biāo)準(zhǔn)，繪制血清miRNAs診斷結(jié)腸癌的ROC曲線，計(jì)算ROC曲線下面積及漸進(jìn)95%可信區(qū)間。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌患者血清中miRNA的芯片表達(dá)譜

芯片雜交結(jié)果經(jīng)過數(shù)據(jù)分析，根據(jù)改變倍數(shù)≥1.5且P＜0.05篩選與正常人血清相比在結(jié)腸癌患者中有差異表達(dá)的miRNA。共有87種miRNA在結(jié)腸癌患者血清和正常人血清標(biāo)本中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中上調(diào)表達(dá)有39個，下調(diào)表達(dá)有48個。差異表達(dá)的87種miRNA的熱圖結(jié)果見圖1、表2。

2.2 qRT-PCR對miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證

通過查閱文獻(xiàn)，在芯片篩選出的87種差異表達(dá)的miRNA中有12種與結(jié)腸癌的細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)移等相關(guān)[10]。用qRT-PCR對這12種miRNA進(jìn)行驗(yàn)證。其中 miR-31、miR-141、miR-224-3p、miR-576-5p和miR-4669這5個miR分子在結(jié)腸癌癥患者中的表達(dá)相對于正常對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見圖2、表3。

2.3 ROC曲線分析

以手術(shù)切除結(jié)腸癌組織的病理報(bào)告為金標(biāo)準(zhǔn)，繪制 miR-31、miR-141、miR-224-3p、miR-576-5p和miR-4669及由這5個miR分子組成的miR-表達(dá)譜在診斷結(jié)腸癌中的ROC曲線。見圖3、表4。

圖1 結(jié)腸癌患者和正常人血清標(biāo)本miRNA芯片結(jié)果熱圖

表2 結(jié)腸癌患者血清中差異表達(dá)的miRNAs

圖2 miRNAs在結(jié)腸癌組和正常對照組血清中的表達(dá)

表3 miRNAs在結(jié)腸癌組和正常對照組血清中的表達(dá)

圖3 miRNAs診斷結(jié)腸癌ROC曲線

表4 miRNAs診斷結(jié)腸癌ROC曲線下面積及漸進(jìn)95%可信區(qū)間

3 討論

結(jié)腸癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一。結(jié)腸癌發(fā)展過程主要涉及增生、腺瘤和癌變各階段，是一種多步驟、多階段、多基因參與的疾病。近年來，miRNA在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用成為人們研究的熱點(diǎn)。目前研究表明，miRNA具有癌基因和抑癌基因的作用。miRNA微陳列芯片憑借其高通量，快速檢測miRNA表達(dá)水平的優(yōu)點(diǎn)，成為了研究腫瘤發(fā)病機(jī)制，早期診斷，預(yù)后判斷的新方法。

本技術(shù)采用的UniTag?微陳列芯片是中國科學(xué)院蘇州納米技術(shù)與納米仿生研究所開發(fā)的非標(biāo)記miRNA芯片檢測平臺（涵蓋2 154個全譜miRNA，version 19.0），該平臺“基于堆積雜交的通用標(biāo)簽檢測方法”可以區(qū)分只有1個堿基差異的miRNA家族成員，尤其是可以有效排除非活性pri-miRNA與premiRNA前體的交叉雜交信號[7]。芯片篩選結(jié)果顯示共有87種miRNA在結(jié)腸癌患者血清和正常人血清標(biāo)本中有差異表達(dá)，其中上調(diào)表達(dá)有39個，下調(diào)表達(dá)有48個，差異均在1.5倍以上且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過查閱文獻(xiàn)，在芯片篩選出的87種差異表達(dá)的miRNA中有12種與結(jié)腸癌的細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)移等相關(guān)[10]。用qRT-PCR對這12種miRNA進(jìn)行驗(yàn)證。其中 miR-31、miR-141、miR-224-3p、miR-576-5p和miR-4669這5個miR分子在結(jié)腸癌癥患者中的表達(dá)相對于正常對照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，與結(jié)腸癌有關(guān)的miRNAs陸續(xù)被人們發(fā)現(xiàn)。近年來有報(bào)道m(xù)iR-31與結(jié)腸癌有著密切的關(guān)系[11-12]。YANG等[13]發(fā)現(xiàn)miR-31在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中miR-31的表達(dá)量高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織。血液標(biāo)本獲取方便，對血清中miRNA進(jìn)行檢測從而診斷結(jié)腸癌及判斷預(yù)后更適于臨床的應(yīng)用，可是目前有關(guān)miR-31在結(jié)腸癌血清中的報(bào)道并不多見。血清中miR-31表達(dá)量的增加提示miR-31可以作為潛在的腫瘤標(biāo)記物，以miR-31為靶點(diǎn)的治療將可能成為治療結(jié)腸癌的另一重要手段。

miR-141屬于miRNAs進(jìn)化保守家族的一員，是具有上皮組織細(xì)胞特異性的微小RNA。miR-141作為miR200家族的成員之一，在結(jié)直腸癌、乳腺癌和前列腺癌中表達(dá)增高。目前對于結(jié)腸癌中miR-141表達(dá)的研究多見于結(jié)腸癌癥組織和結(jié)腸癌細(xì)胞株，對于結(jié)腸癌血清中miR-141的報(bào)道很少[14]。檢測結(jié)果提示miR-141在結(jié)腸癌患者血清中高表達(dá)。以手術(shù)切除結(jié)腸部位癌癥組織的病理報(bào)告為金標(biāo)準(zhǔn)，血清miR-141診斷結(jié)腸癌的ROC曲線下面積為0.933，具有較好的診斷效能。

OLARU等[15]研究miRNA在正?！仔阅c病→結(jié)腸癌過程中的作用，發(fā)現(xiàn)miR-224在炎性腸病發(fā)展的各個階段都表達(dá)上調(diào)，而且結(jié)腸癌中miR-224的表達(dá)水平高于正常黏膜和炎性腸病。進(jìn)一步研究miR-224對結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，結(jié)果顯示miR-224在細(xì)胞周期的調(diào)控中發(fā)揮了重要作用，其加快了G1期→S期的進(jìn)程，并且發(fā)現(xiàn)這種調(diào)控作用是通過影響細(xì)胞周期調(diào)控因子p21實(shí)現(xiàn)的。在本文的芯片篩查結(jié)果中，miR-224-3p在結(jié)腸癌血清中表達(dá)倍數(shù)是正常人血清的5.4倍。后經(jīng)過Real-time PCR驗(yàn)證，與芯片結(jié)果一致。

BALDEóN等[16]發(fā)現(xiàn)，miR-576-5p在2型糖尿病患者的單核細(xì)胞中的表達(dá)水平升高。同時(shí)，他們還發(fā)現(xiàn)miR-576-5p與年齡有明顯的聯(lián)系，而miR-34c-5p并沒有。miR-576-5p目前在癌癥方面的研究較少。

朱桂璐等[17]對人乳腺癌BT474細(xì)胞及BT474/HER-2 siRNA細(xì)胞miRNAs表達(dá)譜結(jié)果分析，以BT474細(xì)胞為對照組，miR-4669在BT474/HER-2 siRNA細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，提示miR-4669在乳腺癌病情進(jìn)展中可能與HER-2相關(guān)。目前miR-4669在結(jié)腸癌中的研究也很少。隨著循環(huán)miRNA研究的深入，關(guān)于miR-576-3p，miR-4669在癌癥方面的報(bào)道也會日益增多。

本研究分析了miR-31、miR-141、miR-224-3p、miR-576-5p和miR-4669新型miRNA循環(huán)分子標(biāo)志物表達(dá)譜在結(jié)腸癌中的表達(dá)，5個miRNA聯(lián)合起來組成的miRNA循環(huán)分子標(biāo)記物表達(dá)譜在診斷結(jié)腸癌方面比單個miRNA分子的診斷效能更高。miRNA循環(huán)分子標(biāo)志物表達(dá)譜有望成為應(yīng)用于結(jié)腸癌患者臨床診治評估的重要指標(biāo)。將結(jié)腸癌檢查的不適度減至最輕，并提高檢測的敏感性和特異性，為實(shí)現(xiàn)結(jié)腸癌的早期診斷，預(yù)后判斷和延長結(jié)腸癌患者的生存時(shí)間，提高其生存質(zhì)量。

[1]LEE R C, FEINBAUM R L, AMBROS V. The C. elegans hetero-chronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J]. Cell, 1993, 75(5): 843-854.

[2]KOZOMARA A, GRIFFITHS-JONES S. MiRbase: Integrating microRNA annotation and deep-sequencing data[J]. Nucleic Acids Res, 2011, (39): 152-157.

[3]HASHIMOTO Y, AKIYAMA Y, YUASA Y. Multiple-to-multiple relationships between microRNAs and target genes in gastric cancer[J]. PLoS One, 2013, 8(5): e62589.

[4]IWAYA T, YOKOBORI T, NISHIDA N, et al. Downregulation of miR-144 is associated with colorectal cancer progression via activation of mTOR signaling pathway[J]. Carcinogenesis, 2012,33(12): 2391-2397.

[5]ZHANG G J, XIAO H X, TIAN H P, et al. Upregulation of microRNA-155 promotes the migration and invasion of colorectal cancer cells through the regulation of claudin-1 expression[J]. Int J Mol Med, 2013, 31(6): 1375-1380.

[6]CHIANG Y, SONG Y, WANG Z, et al. MicroRNA-192,-194 and-215 are frequently downregulated in colorectal cancer[J]. Exp Ther Med, 2012, 3(3): 560-566.

[7]段德民, 惠利省, 李麗詩, 等. 無標(biāo)記microRNA芯片分析方法的建立與優(yōu)化[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2013, 40(5): 479-489.

[8]HUANG Z, HUANG D, NI S, et al. Plasma microRNAs are promising novel biomarkers for early detection of colorectal cancer[J]. Int J Cancer, 2010, 127(1): 118-126.

[9]SCHMITTGEN T D, LIVAK K J. Analyzing real-time PCR data by the comparative Ctmethod[J]. Nat Protoc, 2008, 3(6): 1101-1108.

[10]HAGGI M, IDO M, NADIA I, et al. The diagnostic and prognostic role of microRNA in colorectal cancer-a comprehensive review[J]. Journal of Cancer, 2013, 4(3): 281-295.

[11]CHAOJIE W, ZONGGUANG Z H, LING W, et al.Clinicopathological signi fi cance of microRNA-31, -143 and-145 expression in colorectal cancer[J]. Dis Markers, 2009, 26(1): 27-34.

[12]SLABY O, SVOBODA M, FABIAN P, et al. Altered expression of miR-21, miR-31, miR-143 and miR-145 is related to clinical pathologic features of colorectal cancer[J]. Oncology, 2007,72(5/6): 397-402.

[13]YANG M H, JIANG Y, CHEN N, et al. Elevated microRNA-31 expression regulates colorectal cancer progression by repressing its target gene SATB2[J]. PLoS One, 2013, 8(12): e85353.

[14]CHENG H Y, ZHANG L N, DAVID E C, et al. Circulating plasma miR-141 is a novel biomarker for metastatic colon cancer and predicts poor prognosis[J]. PLoS one, 2011, 6(3): e17745.

[15]OLARU A V, YAMANAKA S, VAZQUEZ C, et al. MicroRNA-224 negatively regulates p21 expression during late neoplastic progression in inflammatory bowel disease[J]. Inflamm Bowel Dis, 2013, 19(3): 471-480.

[16]BALDEóN R L, WEIGELT K, WIT H D, et al. Type 2 diabetes monocyte microRNA and mRNA Expression: Dyslipidemia associates with increased differentiation-related genes but not in fl ammatory activation[J]. PLoS One, 2015, 10(6): e0129421.

[17]朱桂璐, 許成辰, 吳正升, 等. 篩選并初步分析不同HER-2水平的人乳腺癌BT474細(xì)胞內(nèi)miRNAs差異性表達(dá)[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2014, 30(11): 1206-1210.

Detection of serum microRNA pro fi le in colon cancer and its clinical application value*

Ya-nan Wang1, Zhao-hua Chen2, Wei-chang Chen1
[1. The First Aff i liated Hospital of Soochow University, Suzhou, Jiangsu 215006, China;2. Suzhou Municipal Hospital (Suzhou Hospital Aff i liated to Nanjing Medical University), Suzhou, Jiangsu 215002, China]

ObjectiveTo explore the potential novel serum microRNA (miRNA) pro fi le in colon cancer and discuss its clinical application value.MethodsThe difference of serum miRNA expression between colon cancer patients and healthy people was detected by miRNA microarray chip technology. The differential expression of miRNAs in serum of 60 cases of colon cancer and 60 normal people were validated by qRT-PCR.ResultsA total of 87 miRNAs were differentially expressed in the serum of the colon cancer patients compared to the normal people, among which 39 miRNAs were upregulated and 48 miRNAs were down-regulated. miR-31, miR-141, miR-224-3p, miR-576-5p and miR-4669 expressions in the colon cancer patients were signi fi cantly different from those in the normal control group (P＜ 0.05). MicroRNA pro fi le (including miR-31, miR-141, miR-224-3p,miR-576-5p and miR-4669) has a higher efficiency in diagnosis of colon cancer (area under the ROC curve was 0.992).ConclusionsClinical detection of expression pro fi le of circulating molecular markers miR-31, miR-141,miR-224-3p, miR-576-5p and miR-4669 in colon cancer patients is useful for the diagnosis of colon cancer. It is expected to be an important index for evaluation of clinical diagnosis and treatment in patients with colon cancer.

colon cancer; serum microRNA; expression pro fi le

10.3969/j.issn.1005-8982.2018.01.008

1005-8982（2018）01-0037-07

2017-02-17

蘇州市“科教興衛(wèi)”青年科技項(xiàng)目（No：KJXW2014017）

陳衛(wèi)昌，E-mail：weichangchen@126.com；Tel：0512-67781310

R735.3

A

（張西倩 編輯）