α-倒捻子素對MCF-7乳腺癌增殖、生長和侵襲的影響及其作用機(jī)制

馬林偉，徐紅濤，戴小麗，韓中保

（鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)教研室，江蘇 鹽城 224005）

α-倒捻子素對MCF-7乳腺癌增殖、生長和侵襲的影響及其作用機(jī)制

馬林偉，徐紅濤，戴小麗，韓中保

（鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)教研室，江蘇 鹽城 224005）

目的探討α-倒捻子素對MCF-7乳腺癌增殖、生長和侵襲的影響及其作用機(jī)制。方法采用細(xì)胞增殖實驗（MTS法）研究α-倒捻子素對MCF-7乳腺癌細(xì)胞體外增殖的影響；采用裸鼠皮下移植瘤模型研究α-倒捻子素對MCF-7乳腺癌體內(nèi)生長的影響；采用Transwell實驗研究α-倒捻子素對MCF-7乳腺癌細(xì)胞侵襲的影響；采用免疫組織化學(xué)法研究α-倒捻子素對MCF-7乳腺癌皮下移植瘤組織中翻譯控制腫瘤蛋白（TCTP）、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2及MMP-9蛋白表達(dá)的情況；采用Western blot研究α-倒捻子素對MCF-7細(xì)胞中Erk、P38、MMP-2及MMP-9蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果體外增殖實驗結(jié)果顯示，α-倒捻子素能夠抑制MCF-7乳腺癌細(xì)胞的增殖，且具有濃度和時間依賴性；α-倒捻子素能夠劑量依賴性地抑制MCF-7乳腺癌的體內(nèi)生長；α-倒捻子素能夠抑制MCF-7乳腺癌細(xì)胞的侵襲；免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，α-倒捻子素能夠下調(diào)TCTP、MMP-2及MMP-9的蛋白表達(dá)；Western blot結(jié)果顯示，α-倒捻子素能夠抑制調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)，如磷酸化的Erk、磷酸化的P38、MMP-2及MMP-9。結(jié)論α-倒捻子素能夠抑制MCF-7乳腺癌增殖、生長及侵襲，其機(jī)制可能與抑制調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。

α-倒捻子素；乳腺癌；增殖；生長；侵襲；作用機(jī)制

乳腺癌是全球女性最為常見且危害最大的惡性腫瘤，給人們的健康生活帶來極大威脅[1]。美國最新統(tǒng)計研究表明，全美女性乳腺癌的發(fā)病率和死亡率居高不下[2]。諸多因素可導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生，諸如遺傳[3]、激素分泌紊亂[4]、致癌物誘導(dǎo)[5]、環(huán)境污染[6]及不良生活習(xí)慣[7]等。目前乳腺癌的治療主要還是以手術(shù)切除并輔以放化療為主[8]，這種治療方法確實能夠有效控制患者的病情，延長患者的生存期，但缺點也是極為明顯：①手術(shù)切除乳房，特別是雙側(cè)全乳切除，不僅給女性身體上帶來很大的傷痛，同時給女性精神上也帶來難以彌補(bǔ)的創(chuàng)傷[9]；②放化療雖然能夠有效控制癌細(xì)胞的生長和擴(kuò)散，但其對正常細(xì)胞的殺傷使得患者的免疫力急劇下降，抗病能力驟降，導(dǎo)致患者更加虛弱[10]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，近年來針對乳腺癌的治療出現(xiàn)了一些新療法，如免疫療法[11]、靶向治療[12]、激素療法[13]及內(nèi)分泌療法[14]等。不可否認(rèn)，這些新型療法確有一定療效，也給患者的治療多了一些選擇，但也存在相應(yīng)的問題。以靶向療法為例，單一的靶向治療并不能徹底的殺死腫瘤細(xì)胞，因為作為腫瘤的發(fā)生是多階段、多環(huán)節(jié)、多通路的一個過程，單一的1種或是2種聯(lián)用效果還是不夠理想[15]。因此，還要繼續(xù)找尋新型的治療乳腺癌的方法，而從天然產(chǎn)物中找到能夠抑制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的有效成分是一個很好的方向。α-倒捻子素是從植物山竹中提取分離出來的一種活性成分[16]，研究發(fā)現(xiàn)，α-倒捻子素作為一種雙苯吡酮衍生物，具有多種藥理活性，包括抗菌[17]、抗炎[18]、抗氧化[19]及抗腫瘤[20]等。α-倒捻子素對于乳腺癌的作用已有少量報道，但其研究主要集中在細(xì)胞水平，且研究的內(nèi)容主要是其對乳腺癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)及脂肪酸的合成[21-23]，目前尚未見在動物水平研究α-倒捻子素對乳腺癌的作用，為此本研究將重點放在了體內(nèi)研究上，同時基于腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的主要原因[24]，本研究也考察了α-倒捻子素對乳腺癌細(xì)胞侵襲的影響及可能的作用機(jī)制，為α-倒捻子素在臨床的推廣應(yīng)用提供重要實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人源性乳腺癌細(xì)胞系MCF-7購自中國科學(xué)院昆明動物研究所細(xì)胞庫，BALB/c裸小鼠（雌性，6～8周齡，18～20 g）、SPF級、購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2012-0001]，10%小牛血清、DMEM培養(yǎng)基及0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司，24孔板（含Transwell小室）購自美國Corning公司（批號：07111036），MatrigelTM基底膜基質(zhì)購自美國BD公司（No.2342761，包裝規(guī)格 5 ml），p-Erk、p-P38、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）MMP-2、MMP-9及 GAPDH抗體購自美國Cell Signaling公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞增殖實驗（MTS法）檢測α-倒捻子素對MCF-7細(xì)胞增殖的影響 MCF-7細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基（含10%小牛血清）進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞處于指數(shù)生長期時，用不含EDTA的0.25%的胰酶對細(xì)胞進(jìn)行消化并計數(shù)，用DMEM完全培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)整為4×105個/ml，然后在96孔板中接種以吹打均勻的懸浮細(xì)胞，每孔200μl，接種完畢后置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長到80%～85%左右時，向培養(yǎng)孔中加入不同濃度的α-倒捻子素，組別設(shè)為1、2、4、8、16、32、64μmol和溶劑對照組（DMSO），每個組別設(shè)置5個復(fù)孔，加藥完畢后置培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育。處理12 h后，向每孔加入20μl MTS試劑，向各孔中加入MTS試劑，每孔20μl，然后置培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育3 h。孵育結(jié)束后，利用紫外分光光度計檢測96孔板中各孔的光密度（optocal density，OD）值OD490 nm，實驗重復(fù)3次。然后同上述操作，加藥分別處理24和48 h，其他處理與上述一致，檢測各孔的OD值OD490 nm，實驗重復(fù)3次。

細(xì)胞增殖抑制率計算方法：增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD值/陰性對照組OD值）×100%。

1.2.2 Transwell實驗檢測α-倒捻子素對MCF-7細(xì)胞侵襲的影響 首先在Transwell小室上室的膜表面均勻鋪被上含Matrigel（去生長因子）的DMEM培養(yǎng)基稀釋液（體積比1∶4），完畢后置培養(yǎng)箱中稍微受熱使其凝固，以備后續(xù)實驗使用。將處于指數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞懸液接種在Transwell小室的上室，接種體積為100μl，同時將不同濃度的α-倒捻子素（0～4μmol）接種于上室。將600μl含20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基加入下室，置培養(yǎng)箱中處理24 h，實驗各組均設(shè)3個復(fù)孔。藥物處理結(jié)束后，用棉簽小心將上室中沒有遷移的細(xì)胞拭去，并按下述操作處理：用4%多聚甲醛固定10 min→PBS洗滌→0.1%結(jié)晶紫染色30 min→PBS漂洗3次→置于載玻片上→×200鏡下隨機(jī)選5個視野，計數(shù)→將小室置于400μl/孔的甲醇中將結(jié)晶紫溶解→取200μl溶解液置于96孔板中，于370 nm波長處檢測OD值，計算相對遷移率。

1.2.3 MCF-7裸鼠皮下移植瘤模型檢測α-倒捻子素對腫瘤體內(nèi)生長的影響 按常規(guī)方法復(fù)蘇、傳代及培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，待細(xì)胞傳代至10個100 mm培養(yǎng)皿且細(xì)胞融合至85%以上時，用胰酶將培養(yǎng)皿中的細(xì)胞進(jìn)行消化，然后1 000 r/min，離心3 min，去胰酶，離心后的細(xì)胞用PBS進(jìn)行重懸，10倍稀釋后用細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行計數(shù)。然后用PBS將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107個/ml，置冰上備用。取健康的BALB/c裸小鼠20只，用1 ml注射器吸取0.2 ml（2×106個細(xì)胞）接種于裸小鼠右側(cè)腋窩皮下，重復(fù)上述操作對所有裸小鼠進(jìn)行接種。接種5 d后，選擇復(fù)制模型成功的15只裸鼠，對裸鼠稱重，并隨機(jī)分組，實驗共分為3個組：模型組、α-倒捻子素5 mg/kg組、α-倒捻子素20 mg/kg組，每組5只，實驗組采用灌胃方式連續(xù)給予待測藥物35 d（因α-倒捻子素不溶于水，藥物用食用油進(jìn)行溶解），模型組只給予等體積的食用油。每隔3天稱取每只裸鼠的體重，并用游標(biāo)卡尺測量移植瘤的直徑（長、短徑各測3次，求得長徑均值a和短徑均值b），并計算瘤體積（瘤體積=1/2×a×b2）。給予待測藥物35 d后，將各組裸鼠頸椎脫臼處死動物，剪開皮膚后并小心剝離整個瘤塊，稱重、拍照后，用4%多聚甲醛液固定，備用。

1.2.4 免疫組織化學(xué)法檢測α-倒捻子素對瘤組織中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 將所有實驗樣本進(jìn)行固定、包埋及切片處理，采用免疫組織化學(xué)SP法（鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶法）進(jìn)行樣本檢測。實驗操作步驟按所購試劑盒說明書進(jìn)行。第一抗體：翻譯控制腫瘤蛋白（translationally controlled tumor protein，TCTP）、MMP-2和MMP-9鼠抗人單克隆抗體；第二抗體：免疫組織化學(xué)SP試劑盒、DAB顯色試劑盒。

1.2.5 Western blot檢測α-倒捻子素對MCF-7細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 將約5×106個細(xì)胞加至蛋白裂解液，冰上靜置30 min，低溫離心20 min（12 000 r/min），提取上清液。應(yīng)用BCA定量法計算蛋白的濃度。取60μg總蛋白跑膠（恒壓100 V）。電轉(zhuǎn)膜80 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用含5%脫脂奶粉的TBST將膜封閉1 h。封閉結(jié)束后，用TBST溶液清洗膜5次，每次10 min，然后結(jié)一抗，置4℃冰箱過夜。第2天回收一抗，用TBST溶液清洗膜5次，每次10 min，然后結(jié)二抗，孵育1.5 h后顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphpad 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，樣本均數(shù)間的比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 α-倒捻子素抑制MCF-7細(xì)胞的體外增殖

用α-倒捻子素處理MCF-7細(xì)胞12 h，發(fā)現(xiàn)在8μmol時表現(xiàn)出對腫瘤細(xì)胞的抑制作用；隨著劑量的增加，腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用增強(qiáng)。進(jìn)一步用α-倒捻子素處理MCF-7細(xì)胞24及48 h時，發(fā)現(xiàn)其抑制作用與對照組相比均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，α-倒捻子素能夠抑制MCF-7細(xì)胞的體外增殖。

2.2 α-倒捻子素抑制MCF-7細(xì)胞的侵襲

侵襲實驗中，選取對MCF-7細(xì)胞增殖無明顯影響的濃度：0、1、2和4μmol處理MCF-7細(xì)胞24 h，結(jié)果表明，α-倒捻子素在1μmol時對MCF-7細(xì)胞的侵襲表現(xiàn)出抑制作用，隨著α-倒捻子素濃度的增加，其對MCF-7細(xì)胞侵襲的抑制作用逐漸增強(qiáng)，侵襲出的細(xì)胞數(shù)量減少，且表現(xiàn)出一定的濃度依賴性，見圖2、3。結(jié)果表明，α-倒捻子素能夠抑制MCF-7乳腺癌細(xì)胞的侵襲，且在在一定濃度范圍內(nèi)，表現(xiàn)出濃度依賴性。

圖1 α-倒捻子素對MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

圖2 α-倒捻子素對MCF-7乳腺癌細(xì)胞侵襲的影響 （×200）

2.3 α-倒捻子素抑制MCF-7裸小鼠異種移植瘤的生長

裸小鼠異種移植瘤實驗結(jié)果表明，給藥35 d后，模型組腫瘤體積（1.51±0.036）cm3，α-倒捻子素5 mg/kg組腫瘤體積（0.71±0.029）cm3，α-倒捻子素20 mg/kg組腫瘤體積（0.42±0.023）cm3，與模型組比較，α-倒捻子素5、20 mg/kg組腫瘤體積大小差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=54.725和80.685，均P=0.000）。α-倒捻子素對人乳腺癌裸鼠異種移植瘤的生長具有抑制作用，腫瘤的體積變小，且有一定的劑量依賴性，見圖4、5。該體內(nèi)研究結(jié)果表明，α-倒捻子素能夠抑制MCF-7裸小鼠異種移植瘤的生長。

2.4 α-倒捻子素降低腫瘤組織中TCTP、MMP-2及MMP-9蛋白的表達(dá)

基于TCTP在介導(dǎo)調(diào)控腫瘤生長中的重要作用，將TCTP在腫瘤組織中的表達(dá)作為檢測指標(biāo)[25]。同時基于MMP在腫瘤細(xì)胞侵襲中的作用，將MMP-2和MMP-9作為檢測指標(biāo)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在乳腺癌腫瘤組織中，α-倒捻子素能夠降低TCTP、MMP-2及MMP-9的表達(dá)，見圖6。α-倒捻子素能夠通過下調(diào)TCTP、MMP-2及MMP-9的表達(dá)，發(fā)揮其抑制腫瘤生長和侵襲的能力。

圖4 α-倒捻子素對MCF-7裸鼠皮下移植瘤體內(nèi)生長的影響

圖5 腫瘤體積定量比較

2.5 α-倒捻子素抑制MMP-2、MMP-9、p-Erk及p-P38蛋白的表達(dá)

基于MMP在介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移中的重要作用[26]，選取MMP-2及MMP-9作為檢測指標(biāo)，考察α-倒捻子素對其蛋白表達(dá)的影響；同時基于Ras/Raf信號通路在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖及生長方面的關(guān)鍵作用[27]，選取該通路下游的Erk及P38作為檢測指標(biāo)，考察α-倒捻子素對其蛋白表達(dá)的影響。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，α-倒捻子素能夠劑量依賴性的下調(diào)MMP-2、MMP-9、p-Erk及p-P38蛋白的表達(dá)，但對t-Erk及t-P38蛋白的表達(dá)無明顯影響，見圖7。α-倒捻子素能夠通過下調(diào)MMP的表達(dá)發(fā)揮其抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的作用，同時α-倒捻子素對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用可能與下調(diào)磷酸化的Erk及P38相關(guān)。

圖6 α-倒捻子素對裸鼠皮下移植瘤中相關(guān)蛋白表達(dá)

圖7 α-倒捻子素對MCF-7細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

本文主要考察了山竹里的一種活性成分α-倒捻子素對于乳腺癌生長和侵襲的影響及其作用機(jī)制。實驗結(jié)果表明，α-倒捻子素能夠在體外和體內(nèi)分別抑制乳腺癌的增殖和生長，同時α-倒捻子素能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力。機(jī)制研究方面，本研究選擇了TCTP作為研究對象，研究發(fā)現(xiàn)，TCTP是一個在物種間高度保守、廣譜表達(dá)和多功能的蛋白質(zhì)[28]，能夠①對細(xì)胞骨架的動態(tài)變化、細(xì)胞的生長與增殖及細(xì)胞周期發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，②調(diào)控細(xì)胞凋亡及分化，③保護(hù)細(xì)胞免受應(yīng)激損傷，④介導(dǎo)炎癥反應(yīng)及癌癥發(fā)生[29]。TCTP主要通過蛋白表達(dá)量的快速變化來適應(yīng)細(xì)胞內(nèi)狀態(tài)的改變[29]。本研究通過免疫組織化學(xué)考察了該蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示α-倒捻子素能夠抑制TCTP在乳腺癌瘤組織中的表達(dá)，這表明α-倒捻子素對乳腺癌生長的抑制作用可能與調(diào)控該蛋白的表達(dá)有關(guān)。而在研究α-倒捻子素對乳腺癌細(xì)胞侵襲作用的機(jī)制時，選取了MMP-2和MMP-9作為研究對象，主要是因為它們屬于IV型膠原酶，即所謂的明膠酶，研究證實[30]，明膠酶是目前為止唯一能夠降解IV型膠原的基質(zhì)蛋白水解酶，而細(xì)胞外基質(zhì)的基本骨架恰恰是由IV型膠原組成的。研究發(fā)現(xiàn)[31]，它們可以通過破壞基質(zhì)的降解平衡，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞突破基底膜的屏障，侵襲周圍組織。本研究發(fā)現(xiàn)無論是在乳腺癌腫瘤組織中，還是在乳腺癌細(xì)胞中，α-倒捻子素都能夠下調(diào)MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)，這表明，α-倒捻子素抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲的作用可能與抑制MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)有關(guān)。與此同時，基于Ras/Raf信號通路在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖方面的重要作用，本研究也對該通路的相關(guān)蛋白進(jìn)行了研究，選取該通路下游的Erk及P38作為研究對象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，α-倒捻子素能夠抑制磷酸化的Erk及P38的表達(dá)，而對Erk及P38總蛋白的表達(dá)沒有影響，這表明α-倒捻子素能夠通過介導(dǎo)Erk及P38蛋白的活化，發(fā)揮其調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖的作用。

綜上所述，本研究主要考察了α-倒捻子素對乳腺癌腫瘤在體內(nèi)的生長抑制作用，同時對其體外侵襲能力也做了研究。本研究顯示α-倒捻子素會是一種很有前景的治療乳腺癌的候選化合物，值得進(jìn)一步的研究和開發(fā)。

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Effect of α-mangostin on proliferation, growth and invasion of MCF-7 breast cancer and its mechanisms

Lin-wei Ma, Hong-tao Xu,Xiao-li Dai, Zhong-bao Han
(Department of Clinical Medicine, Yancheng Institute of Health Sciences, Yancheng, Jiangsu 224005, China)

ObjectiveTo explore the effect of α-mangostin on proliferation, growth, and invasion of MCF-7 breast cancer and its mechanisms.MethodsMTS was used to study the effect of α-mangostin onin vitroproliferation of MCF-7 breast cancer cells. MCF-7 breast cancer xenograft model was used to examine the effect of α-mangostin onin vivogrowth of the tumor. The effect of α-mangostin on invasion ability of MCF-7 breast cancer cells was examined by Transwell experiment. Immunohistochemistry was used to study the effect of α-mangostin on the expressions of translationally-controlled tumor protein (TCTP), matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and MMP-9 in MCF-7 subcutaneous transplantation tumor tissue. Western blot was used to detect the expressions of Erk, p38,MMP-2 and MMP-9 proteins.ResultsThe proliferation of MCF-7 breast cancer cells was signi fi cant inhibited by α-mangostinin vitrocompared to the control group. α-mangostin signi fi cantly inhibited the growth of MCF-7 breast cancer subcutaneous transplantation tumorin vivocompared to the control group. The invasion ability of MCF-7 breast cancer cells was signi fi cantly inhibited by α-mangostin. The expressions of TCTP, MMP-2 and MMP-9 were significantly inhibited by α-mangostin as shown in immunohistochemistry. The results of Western blot showed that α-mangostin inhibited the expressions of MMP-2, MMP-9, p-Erk and p-p38.Conclusionsα-mangostin has anti-proliferation, anti-growth and anti-invasion effect on MCF-7 breast cancer, and such effect can attribute to its inhibition of growth and invasion-related proteins in MCF-7 breast cancer.

α-mangostin; breast cancer; proliferation; growth; invasion; action mechanism

10.3969/j.issn.1005-8982.2018.01.007

1005-8982（2018）01-0030-07

2017-02-17

R737.9

A

（張蕾 編輯）