硫化氫對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)效果研究*

陳昆，邱華峰，從靜，張卉

（黃淮學(xué)院護(hù)理學(xué)系，河南 駐馬店 463000）

硫化氫對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)效果研究*

陳昆，邱華峰，從靜，張卉

（黃淮學(xué)院護(hù)理學(xué)系，河南 駐馬店 463000）

目的探討硫化氫（H2S）干預(yù)處理對(duì)大腦中動(dòng)脈栓塞局灶性腦缺血性再灌注損傷（CIRI）模型大鼠腦及神經(jīng)功能的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法選取48只成年雄性SD大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組和實(shí)驗(yàn)組，每組16只（復(fù)制模型過程中如死亡則補(bǔ)足），假手術(shù)組和實(shí)驗(yàn)組采用線栓法結(jié)扎大鼠左側(cè)大腦中動(dòng)脈復(fù)制模型，實(shí)驗(yàn)組于栓線后10 min腹腔注射25μmol/kg硫氫化鈉NaHS生理鹽水，假手術(shù)組和模型組僅給予等體積生理鹽水。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組大鼠的死亡率為23.81%，低于模型組的44.83%，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；3組大鼠的腦梗死體積百分比比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠的腦梗死體積百分比高于假手術(shù)組；實(shí)驗(yàn)組的腦梗死體積百分比低于模型組；3組大鼠的海馬CA1區(qū)的PI3K、p-Akt、Caspase蛋白水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），模型組大鼠海馬CA1區(qū)的p-Akt、Caspase蛋白高于假手術(shù)組，實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬CA1區(qū)的Caspase蛋白低于于模型組，實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬CA1區(qū)的PI3K、p-Akt蛋白高于假手術(shù)組和模型組。結(jié)論H2S干預(yù)處理對(duì)大腦中動(dòng)脈栓塞局灶性腦缺血再灌注損傷模型大鼠有腦脊神經(jīng)缺損功能保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與激活PI3K、p-Akt通路，抑制凋亡相關(guān)蛋白Caspase有關(guān)。

硫化氫；栓塞；局灶性腦缺血；再灌注損傷；神經(jīng)功能

腦缺血性疾病的發(fā)病率逐年攀升，造成腦血管堵塞或腦血血供不足[1]，誘發(fā)腦缺血性再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）。CIRI 能夠直接造成腦神經(jīng)元細(xì)胞壞死或凋亡，形成一系列的嚴(yán)重繼發(fā)癥，具有較高的病死率和致殘率[2]。因此，通過研究CIRI的產(chǎn)生機(jī)制，尋找到一種優(yōu)秀神經(jīng)保護(hù)劑，從而有效預(yù)防其發(fā)生及惡化。

硫化氫H2S作為醫(yī)學(xué)界中常見的氣體信號(hào)分子，具有優(yōu)秀的抗氧化、緩解機(jī)體損傷和消除大腦毒性的作用[3]。H2S能夠保護(hù)腦缺血性損傷，其機(jī)制可能與血管平滑肌及促血管細(xì)胞炎癥因子相關(guān)[4]，但具體過程仍需進(jìn)一步研究。筆者選擇局灶性CIRI模型大鼠作為研究對(duì)象，旨在探討H2S對(duì)模型大鼠腦及神經(jīng)功能的保護(hù)作用，并較深入分析其作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取48只成年雄性SD大鼠（SPF級(jí)），體重220～250 g，平均（240±15）g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，動(dòng)物合格證號(hào)：皖醫(yī)實(shí)動(dòng)準(zhǔn)字第01號(hào)。動(dòng)物喂養(yǎng)條件：自由進(jìn)食進(jìn)水、光照12 h、室溫23～25℃、相對(duì)濕度40%～60%，實(shí)驗(yàn)前禁食8 ～ 12 h[5]。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與儀器

兔抗鼠Caspase-3、PI3K、p-Akt多克隆抗體購自上海索萊寶生物科技有限公司，抗熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）多克隆抗體購自武漢云克隆科技股份有限公司，抗β-actin單克隆抗體購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，硫氫化鈉NaHS水合物購自上海容創(chuàng)生物技術(shù)有限公司，CM1800Leica冷凍切片機(jī)和RM2135Leica石蠟切片機(jī)購自德國Leica公司。

1.3 模型的復(fù)制

大鼠腹腔注射350 mg/kg 10%水合氯醛全身麻醉后，平放于手術(shù)臺(tái)上，取頸正中切口，逐漸分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎左側(cè)頸外動(dòng)脈主干，再結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端，微動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈。近頸外動(dòng)脈起始處剪開頸總動(dòng)脈，于頸內(nèi)動(dòng)脈端插入尼龍線栓頭，后緩慢上推撤出微動(dòng)脈夾，逐層縫合。將處于麻醉狀態(tài)大鼠固定放入鼠籠，至其自然蘇醒后提起頸部雙側(cè)總動(dòng)脈，用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉形成全腦缺血。待大鼠無翻正反射，呼吸頻率加快、毛豎立、眼發(fā)白和瞳孔放大，則代表模型復(fù)制成功。在模型復(fù)制過程中需仔細(xì)操作，避免造成模型鼠的死亡。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

將57只大鼠隨機(jī)分為3組：①假手術(shù)組，全部大鼠行假手術(shù)，將其雙側(cè)頸總動(dòng)脈及翼小孔分別暴露，無缺血處理；②模型組，大鼠腹腔注射350 mg/kg 10%水合氯醛全身麻醉后，手術(shù)分離其雙側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎左側(cè)頸外動(dòng)脈主干，再結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端，微動(dòng)脈夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈。近頸外動(dòng)脈起始處剪開頸總動(dòng)脈，于頸內(nèi)動(dòng)脈端插入尼龍線栓頭，緩慢上推撤出微動(dòng)脈夾，逐層縫合。將處于麻醉狀態(tài)大鼠固定放入鼠籠，自然蘇醒后提起頸部雙側(cè)總動(dòng)脈后用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉形成全腦缺血；③實(shí)驗(yàn)組：大鼠模型復(fù)制方式與模型組一致，模型復(fù)制成功后腹腔注射NaHS水合物48μmol/kg，雙側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞30 min。假手術(shù)組和模型組僅給予等體積生理鹽水。模型復(fù)制過程中，每組16只成功，3只死亡。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.5.1 死亡率 采用Longa 5分制對(duì)大鼠的神經(jīng)缺陷程度進(jìn)行評(píng)價(jià)，0分表示無神經(jīng)功能缺陷；1分表示輕度局灶性神經(jīng)功能缺陷，不能完全伸展對(duì)側(cè)前肢；2分為中度局灶性神經(jīng)功能缺陷，大鼠存在向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈的情況；3分表示重度局灶性神經(jīng)功能缺陷，大鼠向?qū)?cè)傾倒；4分表示大鼠不能獨(dú)立行走、意識(shí)減低。比較3組大鼠腦梗死體積的差異和腦梗死體積百分率。

1.5.2 大腦海馬CA1區(qū)相關(guān)蛋白 比較3組大鼠PI3K、p-Akt、Caspase的表達(dá)差異。

1.6 腦梗死體積測(cè)量

3組大鼠腹腔注射0.50 ml/100 mg 10%水合氯醛全身麻醉，離斷鼠頭開顱取腦，將腦置入冰水沖洗干凈，-20℃下靜置20 min后取出，從前往后取冠狀切片，厚2.0 mm，切5片。置于1% TTC磷酸緩沖液內(nèi)，37℃避光孵育30 min，腦正常組織染成紅色，梗死組織則為白色。對(duì)腦切片拍照后，將圖片數(shù)據(jù)傳輸至計(jì)算機(jī)，使用Image-pro plus軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算腦梗死容積，腦梗死容積=腦切片壞死區(qū)面積×切片厚度，將全部大鼠腦切片梗死容積相加得到全腦總梗死容積，梗死體積百分比=梗死體積/鼠大腦體積×100%。

1.7 免疫組織化學(xué)法

SABC免疫組織化學(xué)法染色測(cè)定3組大鼠大腦海馬CA1區(qū)的PI3K、p-Akt、Caspase的表達(dá)，取測(cè)定梗死面積的切片37℃下復(fù)溫1 h，切片置于PBS液，洗3次，5 min/次。于3%過氧化氫與甲醇體積比1∶10混合液內(nèi)，37℃水浴40 min。置于PBS液，洗3次，5 min/次。切片于高壓煮沸的檸檬酸緩沖液瓷缸內(nèi)煮5 min，取出瓷缸自然冷卻至室溫。取冷卻后的切片置于PBS液，洗3次，5 min/次。取出切片脫水、指甲油包裹、10%山羊血清封閉，室溫下靜置2 h，滴入一抗（PI3K、p-Akt、Caspase抗體和PBS按1∶100稀疏），室溫孵育1 h，4℃冰箱過夜孵育。取出切片室溫復(fù)溫1 h，置于PBS液，洗3次，5 min/次，清除切片水分。DAB顯色，各蛋白呈現(xiàn)紅褐色陽性染色結(jié)果，用水沖洗30 min。切片梯度酒精脫水、中性樹膠封片后，通風(fēng)處晾干，顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有計(jì)量資料滿足正態(tài)分布、方差齊性，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，3組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠的死亡率及神經(jīng)功能缺陷評(píng)分比較

模型組共用29只大鼠、死亡13只，實(shí)驗(yàn)組共用大鼠19只、死亡3只，假手術(shù)組無大鼠死亡，實(shí)驗(yàn)組大鼠的死亡率為23.81%，低于模型組的44.83%，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.356，P=0.037）。假手術(shù)組、模型組及實(shí)驗(yàn)組大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分分別 為（0.00±0.00）、（3.31±0.57） 和（2.26±0.66）分，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=49.084，P=0.000）；進(jìn)一步兩兩比較，模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分較假手術(shù)組高（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分較模型組高（P＜0.05）。

2.2 3組大鼠的腦梗死體積百分比比較

假手術(shù)組、模型組及實(shí)驗(yàn)組大鼠的腦梗死體積百分比分別為（0.00±0.00）%、（36.35±3.89）%和（21.74±3.72）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=28.627，P=0.000）；進(jìn)一步兩兩比較，模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠的腦梗死體積百分比高于假手術(shù)組（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組大鼠的腦梗死體積百分比低于模型組（P＜0.05）。見圖 1。

2.3 3組 大鼠 海 馬 CA1區(qū) 的 PI3K、p-Akt、Caspase蛋白表達(dá)比較

3組大鼠海馬CA1區(qū)的PI3K、p-Akt、Caspase蛋白表達(dá)水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較，模型組大鼠海馬CA1區(qū)的 p-Akt、Caspase蛋白高于假手術(shù)組（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬CA1區(qū)的Caspase蛋白低于模型組（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組大鼠海馬CA1區(qū)的PI3K、p-Akt蛋白高于假手術(shù)組和模型組（P＜0.05）。見附表和圖2。

圖1 3組大鼠的腦梗死組織

附表 大鼠海馬CA1區(qū)的PI3K、p-Akt、Caspase蛋白表達(dá)比較 （n =16，±s）

附表 大鼠海馬CA1區(qū)的PI3K、p-Akt、Caspase蛋白表達(dá)比較 （n =16，±s）

注：1）與假手術(shù)組比較；P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05

假手術(shù)組 0.167±0.032 0.204±0.051 0.249±0.094模型組 0.163±0.029 0.245±0.0491） 0.571±0.1261）實(shí)驗(yàn)組 0.286±0.0411）2） 0.357±0.0561）2） 0.336±0.1111）2）F值 22.761 19.864 31.863

圖2 3組大鼠海馬CA1區(qū)的PI3K、p-Akt、Caspase蛋白表達(dá) （免疫組織化學(xué)法×400）

3 討論

CIRI可致腦組織損傷，并累及腦中樞神經(jīng)，形成繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞壞死或凋亡，造成患者死亡或殘疾[6]。這是因?yàn)槌Ｒ?guī)狀態(tài)下，人體內(nèi)活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）生成和代謝清除保持動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)[7]。當(dāng)人體處于CIRI病理狀態(tài)時(shí)，其抗氧化功能出現(xiàn)障礙，造成ROS無法被清除而蓄積，從而攻擊腦組織等機(jī)體組織，即形成氧化應(yīng)激反應(yīng)，其能直接促使腦組織或神經(jīng)組織細(xì)胞壞死[8]，并可經(jīng)線粒體通路、DNA修復(fù)酶及轉(zhuǎn)錄因子，誘發(fā)連鎖式的成批細(xì)胞凋亡，故筆者認(rèn)為通過探討CIRI的最佳防治手段具有十分重要的醫(yī)學(xué)研究?jī)r(jià)值。

CIRI的產(chǎn)生機(jī)制較復(fù)雜，其中腦缺血可引發(fā)自由基過表達(dá)，從而嚴(yán)重氧化損害腦組織細(xì)胞，屬于誘發(fā)CIRI主要因素之一[9]。而腦缺血誘發(fā)腦組織損傷，造成炎癥因子表達(dá)上升，產(chǎn)生大量毒性物質(zhì)，侵蝕神經(jīng)組織，造成神經(jīng)細(xì)胞壞死及星形細(xì)胞水腫，也可形成CIRI[10]。因此，筆者認(rèn)為預(yù)防CIRI產(chǎn)生及惡化的首要手段應(yīng)是選擇合適外源性保護(hù)因子，降低腦缺血患者機(jī)體內(nèi)氧自由基或炎癥因子表達(dá)水平。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者選擇H2S作為抵抗CIRI的氣體保護(hù)分子，這是因?yàn)槠淠軌蛘{(diào)控海馬磷酸化環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白和海馬神經(jīng)元腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子mRNA表達(dá)上調(diào)[11]，從而使得生物體腦缺血程度得到緩解，間接減輕CIRI對(duì)腦組織的損傷程度。有研究顯示，H2S能夠增強(qiáng)CIRI模型大鼠腦組織內(nèi)超氧化物酶活性，并降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生[12]，有效降低自由基表達(dá)，保證細(xì)胞膜免受氧化反應(yīng)侵害。本實(shí)驗(yàn)選擇線栓法復(fù)制CIRI大鼠模型，并使用H2S對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)干預(yù)，結(jié)果顯示該組死亡率低于模型組，這表明H2S還可有效降低CIRI大鼠死亡率，筆者推斷H2S可能通過抑制氧自由基表達(dá)，緩解CIRI大鼠腦組織損傷，從而降低大鼠死亡率。

既往文獻(xiàn)顯示[13]，CIRI可致大鼠大腦皮質(zhì)缺血，從而造成其側(cè)前肢出現(xiàn)明顯的運(yùn)動(dòng)功能障礙，而缺血性低灌注腦梗死體積越大，CIRI大鼠的運(yùn)動(dòng)功能障礙越嚴(yán)重。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者測(cè)得模型組和實(shí)驗(yàn)組大鼠的腦梗死體積百分比高于假手術(shù)組，而實(shí)驗(yàn)組的腦梗死體積百分比低于模型組；這表明H2S能夠縮小CIRI大鼠腦梗死體積，緩解缺血性腦神經(jīng)損傷，從而側(cè)面證明H2S可能對(duì)預(yù)防CIRI所引起肢體功能障礙或甚至殘疾具有積極意義。

在本實(shí)驗(yàn)中，筆者對(duì)CIRI誘發(fā)腦組織細(xì)胞及神經(jīng)組織細(xì)胞凋亡機(jī)制進(jìn)行評(píng)估。細(xì)胞凋亡受到多種凋亡因子調(diào)控，而這些因子也是在和相關(guān)信號(hào)通路結(jié)合后被激活，造成中性粒細(xì)胞聚集、大量氧自由基合成及增加線粒體鈣超載度等誘細(xì)胞凋亡因素。通過分析，筆者選擇PI3K-Akt信號(hào)通路作為實(shí)驗(yàn)中評(píng)估指標(biāo)之一，這是因?yàn)樵撔盘?hào)通路參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及凋亡，并由多靶點(diǎn)組成，并和磷酸化Akt基因相互作用，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)和促凋亡蛋白活性水平產(chǎn)生影響，間接影響腦組織及神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞活性、發(fā)育、分化、增殖和凋亡。文獻(xiàn)顯示[14]，PI3K/P-Akt越高，細(xì)胞存活率越高，細(xì)胞凋亡則反之，而在腦缺血早期給患者提供外源性PI3K及p-Akt，能夠減輕缺血性腦組織損傷，同時(shí)促使p-Akt蛋白表達(dá)下調(diào)。在本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組PI3K和p-Akt蛋白高于假手術(shù)組和模型組，這表明H2S可使實(shí)驗(yàn)組大鼠機(jī)體PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)增高，從而緩解腦組織及神經(jīng)組織細(xì)胞凋亡，減輕CIRI。

有研究表明[15]，Caspase-3能夠影響腦缺血后神經(jīng)元損傷，并可直接促使神經(jīng)元凋亡；而高活性Caspase-3能夠造成多種蛋白質(zhì)底物失活，造成其促修復(fù)、復(fù)制和轉(zhuǎn)錄DNA和mRNA的功能障礙；同時(shí)磷酸化Akt能降低Caspase-3活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CIRI確實(shí)可致大鼠Caspase-3蛋白表達(dá)上升，而H2S預(yù)處理能夠使得CIRI大鼠Caspase-3蛋白降低，從而對(duì)CIRI大鼠腦損傷進(jìn)行緩解和保護(hù)。

筆者在既往研究基礎(chǔ)上，證明通過H2S干預(yù)可使CIRI對(duì)大鼠腦組織損傷程度降低，可降低局灶性缺血性再灌注所誘發(fā)的死亡率及神經(jīng)功能障礙程度，而H2S這種干預(yù)機(jī)制可能通過直接影響各類誘發(fā)腦組織及神經(jīng)組織細(xì)胞凋亡的基因蛋白表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)，但更詳細(xì)的作用過程仍需進(jìn)一步研究完善。

綜上所述，H2S干預(yù)處理能夠保護(hù)大腦中動(dòng)脈栓塞局灶性腦缺血再灌注損傷模型大鼠的腦組織，其作用機(jī)制可能和激活PI3K、p-Akt通路抑制凋亡相關(guān)蛋白Caspase有關(guān)，該研究結(jié)果可能為臨床治療CIRI患者提供新方向。

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Experimental study on protective effect of H2S on focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats*

Kun Chen, Hua-feng Qiu, Jing Cong, Hui Zhang
(Nursing Department of Huanghuai College，Zhumadian, Henan 463000, China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of hydrogen sulfide (H2S) on the brain and nerve function in rats after focal cerebral ischemia-reperfusion injury and its mechanism.MethodsForty-eight adult male SD rats were randomly divided into sham group, model group and experimental group with 16 in each group(the number was complemented in case of death during modeling process). In the model group and the experimental group, suture method was used to ligate the left middle cerebral artery of the rats for modeling; 10 min after suture,the experimental group had intraperitoneal injection of 25 μmol/kg NaHS saline solution, but the sham group and the model group only

equal volume of saline.ResultsThe mortality rate of 23.81% in the experimental group was signi fi cantly lower than 44.83% in model group (P＜ 0.05). The percentage of cerebral infarct volume in the model group and the experimental group was signi fi cantly higher than that in the sham group (P＜ 0.05); the infarct volume percentage of the experimental group was signi fi cantly lower than that of the model group (P＜ 0.05).p-Akt and caspase in the hippocampal CA1 region of the model group were signi fi cantly higher than those of the sham group (P＜ 0.05) . Caspase protein in the hippocampal CA1 region of the rats in the experimental group was signi fi cantly lower than that in the model group (P＜ 0.05). PI3K and p-Akt in the hippocampal CA1 region of the rats in the experimental group were signi fi cantly higher than those in the sham group and the model group(P＜ 0.05).ConclusionsH2S intervention has protective effect on brain spinal nerve function in the treatment of focal cerebral ischemia-reperfusion injury rat model due to cerebral artery occlusion, its mechanism may be related to the activation of PI3K/p-Akt pathway and inhibition of apoptosis-related protein caspase.

hydrogen sul fi de; embolism; focal cerebral ischemia; reperfusion injury; neurological function

10.3969/j.issn.1005-8982.2018.01.003

1005-8982（2018）01-0011-05

2016-12-16

黃淮學(xué)院青年骨干教師資助計(jì)劃（No：院字[2013]101號(hào)）；2014年河南省教育廳項(xiàng)目（No：14B180006）

從靜，E-mail：1132548483@qq.com

R-332；R743.3

A

（張蕾 編輯）