農(nóng)田潮土養(yǎng)分耦合循環(huán)的微生物學機理研究進展

林先貴，馮有智，陳瑞蕊

（土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室/中國科學院南京土壤研究所，江蘇南京 210008）

農(nóng)田潮土養(yǎng)分耦合循環(huán)的微生物學機理研究進展

林先貴，馮有智，陳瑞蕊

（土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室/中國科學院南京土壤研究所，江蘇南京 210008）

科學施肥是實現(xiàn)農(nóng)業(yè)增產(chǎn)和土壤健康的重要手段。深入認知土壤微生物驅(qū)動的養(yǎng)分元素循環(huán)過程對于評價和指導科學施肥具有極為重要的意義。近年來不同施肥策略對土壤微生物影響的認知雖取得長足進步，但多限于單一養(yǎng)分元素的影響。土壤養(yǎng)分元素循環(huán)過程及與碳循環(huán)過程具有不可分割性，互作和協(xié)同也是土壤微生物的重要特性之一。因此，揭示土壤微生物介導的養(yǎng)分元素的耦合會更有助于我們?nèi)媪私廪r(nóng)田土壤養(yǎng)分循環(huán)過程和指導科學施肥。筆者研究團隊多年來以中國科學院封丘農(nóng)業(yè)生態(tài)試驗站養(yǎng)分平衡長期定位試驗為平臺，利用土壤微生物學、分子生態(tài)學、微量熱和同位素測定等技術(shù)，系統(tǒng)研究了不同施肥策略下潮土微生物介導的碳、氮、磷元素循環(huán)及耦合過程。本文綜述相關(guān)研究成果。對于缺磷潮土，磷肥施用能夠提高微生物生物量碳氮、轉(zhuǎn)化酶活性、脲酶活性、呼吸強度及微生物代謝活性等，使得微生物能夠保障土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化與作物養(yǎng)分吸收，增加潮土綜合碳氮匯效應(yīng)，“高效低排”地為生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)；與之相反，缺施磷肥條件下，即使長期施用其它養(yǎng)分如氮肥，潮土微生物代謝效率仍然低下，且代謝過程會損失更多碳氮素，不利于潮土碳氮累積，致使土壤質(zhì)量無法提高，還加劇了生態(tài)環(huán)境的污染。在闡明了微生物對潮土養(yǎng)分的響應(yīng)與反饋后，還進一步揭示了潮土碳磷耦合的微生物學機制，提出了“缺磷耗碳，增碳活磷”的理論框架。長期缺磷使得外源碳經(jīng)由微生物轉(zhuǎn)化進入潮土有機碳庫的比例減少，卻增加了外源碳的凈礦化量，使得更多外源碳以CO2形式排放到大氣，即缺磷潮土不利于外源碳向潮土有機碳的轉(zhuǎn)化。但是，外源碳的添加能夠長效刺激缺磷潮土中微生物的增殖，特別是解磷微生物。該過程可以使得土壤化學固持的磷素轉(zhuǎn)移到微生物體內(nèi)，增加了潮土中潛在有效磷含量，后續(xù)可以提供給植物利用，即外源碳的添加能夠通過解磷微生物活化土壤中不可利用態(tài)磷素。最后，對今后農(nóng)田土壤養(yǎng)分耦合循環(huán)的微生物學研究方向和內(nèi)容進行了展望。這些結(jié)果會加深對科學施肥重要性的認知，有助于指導調(diào)控土壤微生物更好地服務(wù)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)。

施肥；土壤；微生物；養(yǎng)分耦合

科學施肥是實現(xiàn)農(nóng)業(yè)增產(chǎn)和土壤健康的重要手段之一。土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分參與了土壤有機質(zhì)分解、腐殖質(zhì)形成、土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和循環(huán)等過程，在土壤肥力形成和持續(xù)發(fā)展中起到關(guān)鍵性作用。因此，土壤微生物多樣性和功能是衡量土壤地力和作物生產(chǎn)力的重要指標，深入認知土壤微生物參與土壤有機質(zhì)和養(yǎng)分循環(huán)的過程，發(fā)揮其地下生物功能，對于評價和指導科學施肥具有極為重要的意義。近20年來，特別是近10年來由于先進技術(shù)和方法的強力推動，土壤微生物對不同施肥策略響應(yīng)和反饋的研究呈現(xiàn)爆發(fā)式增長。這些研究成果實質(zhì)性地推動了微生物在農(nóng)田養(yǎng)分循環(huán)和土壤地力提升過程中重要性的認知。但是我們也注意到研究多聚焦于單個養(yǎng)分元素層面，而養(yǎng)分元素間的耦合，以及養(yǎng)分元素和有機碳之間關(guān)聯(lián)的微生物學機理有待深入。

互作和耦合是土壤微生物的重要特性之一 (圖1)[1]。微生物介導的養(yǎng)分循環(huán)過程具有耦合性和整體性。從生物體元素組成上說，碳不僅是構(gòu)成生物細胞骨架的主要元素，也是生物質(zhì)能的主要儲存物質(zhì)；氮素是細胞蛋白質(zhì)等物質(zhì)的重要組成元素，氮素的攝入為酶類構(gòu)建和活性提高提供了必要的保證；磷素主要是脂類、核酸類、ATP等物質(zhì)的組成元素，它在生物體內(nèi)各種代謝 (碳代謝、蛋白質(zhì)代謝和脂肪代謝) 中起到重要作用。微生物代謝生長需要碳、氮、磷等多種元素，因此就必然會同時涉及多元素的循環(huán)。從生物地球化學循環(huán)上說，電子 (能量) 交互是生態(tài)系統(tǒng)元素耦合循環(huán)的內(nèi)在驅(qū)動力。土壤有機碳是還原性物質(zhì)。微生物在氧化這些物質(zhì)時，會釋放多余的電子 (還原力)，而其他元素例如氧、氮、鐵、硫、錳等元素可以作為電子受體消除因還原力過剩而導致的土壤碳代謝受阻，這種情況在厭氧環(huán)境中尤為明顯。同時，氮、鐵、硫、錳等元素的氧化也可為微生物提供能量促進后者的生長和碳的同化。由此可見，土壤有機碳循環(huán)影響微生物介導的養(yǎng)分循環(huán)，而不同施肥策略下各類養(yǎng)分循環(huán)對微生物群落又存在必然反饋，影響了土壤有機碳的累積。有機碳的累積是農(nóng)田土壤地力提升的重要指標，因此從土壤微生物介導的養(yǎng)分元素循環(huán)及其與土壤碳循環(huán)的關(guān)聯(lián)這一全新視角進行科學研究，有助于更全面了解農(nóng)田土壤養(yǎng)分循環(huán)過程和指導科學施肥，更好地服務(wù)于農(nóng)田地力提升。本課題組以中國科學院封丘農(nóng)業(yè)生態(tài)試驗站 (簡稱封丘站)養(yǎng)分平衡長期定位試驗為平臺，以7種長期不同施肥處理[不施肥對照 (Control)、有機肥 (OM)、有機無機肥配施 (1/2OMN)、施用化肥 (NPK、NP、NK和PK)]的土壤為供試材料，系統(tǒng)研究了潮土中微生物介導的碳、氮、磷元素的循環(huán)耦合，同時闡明了微生物對潮土養(yǎng)分的響應(yīng)與反饋，進一步揭示了潮土碳磷耦合的微生物學機制，兼具理論意義和實踐價值。

圖1 微生物介導的元素耦合循環(huán)示意圖[1]Fig. 1 Schematic diagram of microbial mediated element coupling cycle

封丘站于1983年5月建立在河南省封丘縣潘店鄉(xiāng) (東經(jīng) 114°24′、北緯 35°00′)，隸屬于中國科學院南京土壤研究所。1988年經(jīng)中國科學院批準，正式向國內(nèi)外開放，2001年被國家科技部批準為國家重點野外科學觀測實驗站。封丘站是國家和中國科學院部署在黃淮海平原從事農(nóng)業(yè)、資源、生態(tài)和環(huán)境研究的一個最主要的野外試驗基地。針對黃淮海平原糧食生產(chǎn)現(xiàn)狀和面臨問題，重點圍繞潮土質(zhì)量演變規(guī)律、農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力持續(xù)提升、水土養(yǎng)分資源高效利用等系列目標開展了系統(tǒng)研究，取得了一系列重要研究成果，為黃淮海區(qū)域農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展提供了重要理論和技術(shù)支撐。

本課題組自21世紀初以來，系統(tǒng)研究潮土養(yǎng)分循環(huán)的微生物學機制。首先針對平衡施肥，特別是施用有機肥促進潮土地力提升的現(xiàn)狀，從土壤微生物學特性揭示了其內(nèi)在機制。研究發(fā)現(xiàn)磷素是潮土微生物功能和多樣性的關(guān)鍵因子，添加磷素能夠提高微生物生物量、酶活性、代謝活性，同時降低微生物熱散逸，進而利于潮土地力提升。在明確磷素對潮土微生物的影響后，本課題組于2011年前后進一步研究磷素相關(guān)功能微生物—叢枝菌根真菌對潮土不同施肥的響應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)施用磷肥可通過“生物地下交易”法則，使得作物對解磷微生物依賴性下降，將更多的光合產(chǎn)物碳分配給其他微生物，達到改善潮土生物學特性的效果。這些結(jié)果暗示了潮土元素循環(huán)的耦合性，特別是碳磷循環(huán)。因此，近年來本課題組關(guān)注潮土養(yǎng)分耦合的微生物學機制，初步發(fā)現(xiàn)缺磷使得經(jīng)由微生物轉(zhuǎn)化進入土壤有機碳庫的碳比例減少，不利于潮土對碳的固持，即“缺磷耗碳”；但是外源碳的添加能夠增殖解磷微生物，進而活化潮土中不可利用態(tài)磷素，達到“增碳活磷”的效果。鑒于磷素是潮土微生物的限制性因子，本文將從磷素功能微生物對潮土不同施肥的響應(yīng)，磷素對潮土碳氮循環(huán)微生物學特性的影響，潮土碳磷耦合的微生物學機制等4個方面，對本課題組10余年來潮土養(yǎng)分耦合循環(huán)微生物工作進行總結(jié)。

1 磷肥施用對潮土叢枝菌根真菌的影響

潮土中磷素嚴重虧缺已成為提高作物產(chǎn)量的主要限制因素。已有結(jié)果表明，黃淮海平原上潮土生產(chǎn)潛力很大，磷肥配合施用的交互增產(chǎn)效益極其顯著，因此科學施肥增加土壤磷素的積累與利用是提高潮土耕地質(zhì)量的重要措施。鑒于土壤微生物間存在“生物地下交易”法則[2]，磷素的缺失和添加必然會改變土壤碳氮循環(huán)相關(guān)微生物多樣性和功能。因此，以磷素為核心的潮土養(yǎng)分循環(huán)耦合性及其微生物學機制可視為一種研究農(nóng)田土壤養(yǎng)分循環(huán)耦合性的模式體系。

叢枝菌根真菌 (arbuscular mycorrhizal fungi，AMF) 是陸地生態(tài)系統(tǒng)最典型的植物–微生物共生體系，也是一類參與磷素生物地球化學循環(huán)過程的關(guān)鍵功能微生物，同時它們在碳氮循環(huán)中扮演著重要角色。AMF和植物通過“生物地下交易”法則，進行著物質(zhì)和能量的交換：植物將光合產(chǎn)物以碳源的形式輸送給AMF；作為反饋，AMF為植物吸收更多的磷素等養(yǎng)分，以促進植物生長。此外，宿主植物會根據(jù)環(huán)境的變化，“選擇性”放棄某些AMF物種，將更多的光合產(chǎn)物分配給其它微生物，實現(xiàn)碳素–養(yǎng)分元素的耦合，以促進土壤地力可持續(xù)發(fā)展。因此，AMF群落的變化不但可以表征土壤質(zhì)量和健康，還可以敏銳地反映土壤生態(tài)系統(tǒng)的變化。

通過高通量測序，我們共獲得了59611個AMF的特異性片段序列，形成70個OTUs (圖2a)[3]，主要分布在Glomeraceae和Gigasporaceae二個科中(圖2b)[3]。不同施肥處理間多樣性指數(shù)的比較發(fā)現(xiàn)磷肥施用降低了潮土中AMF多樣性 (圖3)[3]。與NK和對照 (Control) 相比，NP、NPK和OM處理顯著降低了AMF的PD (phylogenetic diversity) 和Shannon多樣性指數(shù)，以及Chao1和觀測物種數(shù)的數(shù)量。NP、NPK和OM處理間的AMF多樣性指數(shù)并沒有差異。為了驗證該結(jié)果的可靠性，我們利用傳統(tǒng)的分離和鑒定方法研究了AMF孢子多樣性的變化，得到了一致的結(jié)果 (表1)[4]。

不同施肥處理下潮土中AMF群落組成如圖4[3]所示。與缺磷施肥NK和不施肥的Control相比，長期施用磷肥，如NP、NPK和OM，均顯著減少了AMF的豐富度，其中就具體物種而言顯著降低了Acaulosporacea和Gigasporaceae的比例。

圖2 潮土中優(yōu)勢真菌 (a) 和叢枝菌根真菌群落 (b) 組成Fig. 2 The dominant fungi of fluvo-aquic soil (a) and the community composition of AMF (b)

主成分分析 (PCA) 更直觀地展示AMF群落結(jié)構(gòu)對不同施肥處理的響應(yīng) (圖5a)[3]。沿著PCA橫坐標(貢獻率為88.2%)，不施磷肥的NK和Control與施磷肥的NP、NPK和OM顯著分離。該現(xiàn)象說明磷肥是潮土中AMF群落結(jié)構(gòu)分異的主要原因。隨后，我們關(guān)聯(lián)了環(huán)境變量，如土壤pH值、土壤有機碳 (SOC)和全氮 (TN) 含量、有效鉀 (AK) 和有效磷 (AP) 含量、土壤微生物生物量、酶活性等和AMF群落結(jié)構(gòu)的變化 (圖5b)[3]，進行了典范對應(yīng)分析 (Canonical correspondence analysis，CCA)，以揭示各個土壤理化性質(zhì)對AMF群落結(jié)構(gòu)變化的影響，以及AMF群落結(jié)構(gòu)變化后對土壤微生物特性的影響。CCA顯示施用磷肥 (NP、NPK和OM) 提升了土壤地力，為作物帶來更多的養(yǎng)分；因此，作物對AMF的依賴性下降，進而會“舍棄”部分AMF，例如Gigaspora、Acaulospora和Scutellospora等，而將更多的光合產(chǎn)物分配給其它土壤微生物；該過程提高了土壤微生物生物量碳和多種酶活性，可促進土壤養(yǎng)分的循環(huán)過程。研究進一步發(fā)現(xiàn)，與土壤物理結(jié)構(gòu)和有機質(zhì)累積密切相關(guān)的易提取球囊霉素與總球囊霉素含量在施用磷肥特別是平衡施肥條件下顯著增加 (圖6)[5]，且施用有機肥處理高于施化肥處理，這說明平衡施肥特別是施用有機肥，能夠通過微生物過程改善土壤物理結(jié)構(gòu)和促進土壤有機質(zhì)的累積。

圖3 不同施肥下潮土叢枝菌根真菌多樣性的變化Fig. 3 The diversity variation of AMF in fluvo-aquic soil under different fertilizations

表 1 不同施肥對土潮土枝菌根真菌孢子多樣性的影響Table 1 Effects of different fertilization on AMF spore diversity in fluvo-aquic soil under different fertilizations

該部分研究揭示了對于缺磷潮土，長期施用磷肥，尤其是平衡施肥影響與根系共生的叢枝菌根真菌，影響了“生物地下交易”過程。磷肥施用緩解了潮土磷素的不足，使得作物對共生的微生物依賴性下降，導致土壤解磷微生物多樣性下降，群落結(jié)構(gòu)發(fā)生分異。由于作物是土壤微生物碳源的主要供給者，該過程暗示了更多源自作物的碳會分配給其他微生物，從而改善了潮土生物特性，利于潮土化學和物理特性，進而有助于潮土農(nóng)田地力的可持續(xù)性。

圖4 不同施肥下潮土叢枝菌根真菌物種組成Fig. 4 The species composition of AMF in fluvo-aquic soil under different fertilizations

圖5 不同施肥下潮土叢枝菌根真菌群落結(jié)構(gòu)的PCA分析 (a) 和CCA分析 (b)Fig. 5 PCA (a) and CCA (b) analysis of community structures of AMF in fluvo-aquic soil under different fertilizations

圖6 不同施肥下潮土易提取球囊霉素和總球囊霉素含量的變化Fig. 6 The content variation of EE-GRSP and T-GRSP in fluvo-aquic soil under different fertilizations

2 磷肥施用對碳轉(zhuǎn)化微生物學特性的影響

有機質(zhì)含量是農(nóng)田土壤地力的最基本構(gòu)成要素。在微生物的驅(qū)動下，土壤有機質(zhì)始終處于積累與降解的動態(tài)平衡之中。研究發(fā)現(xiàn)潮土中磷素缺失對土壤碳累積產(chǎn)生了負面影響，即使在添加其他養(yǎng)分的處理中，如NK處理中，由于磷素缺失也使得其SOC含量低于含磷處理 (NP、NPK、OM和1/2OMN)(表2)[3]。該結(jié)果和20年各處理間土壤有機碳含量的變化一致[6]，證實了磷素在潮土碳循環(huán)中的重要性，即如果不施用磷肥，即使施用其它養(yǎng)分均不能增加土壤有機碳含量。

由于碳是幾乎所有微生物的能源，所以我們以微生物活性來表征微生物驅(qū)動的碳循環(huán)過程。在對碳轉(zhuǎn)化過程相關(guān)微生物的研究中，我們首先利用微量熱技術(shù)研究了磷素對土壤微生物代謝活性的影響。研究發(fā)現(xiàn)在缺磷處理 (Control、NK) 中土壤微生物生長速率慢，它們的熱動力學曲線近似“死線”，具體表現(xiàn)為其微生物熱釋放值低、出峰時間晚 (圖7a)[7]。該現(xiàn)象說明潮土嚴重缺磷幾乎可以抑制所有微生物的代謝活性。為了驗證我們的判斷，通過添加磷源的方式，可以使NK、Control處理受到明顯的激活 (圖7b)[7]，再次說明了磷素的確是限制潮土微生物活性的重要因子。然而，補充磷素后土壤微生物總代謝熱變高，即說明在缺磷潮土中微生物為了獲取磷素，付出更多的能量，能耗更高，會消耗更多的碳源。

由于促進了土壤微生物的代謝活性，磷肥施用顯著增加了土壤微生物生物量碳、碳轉(zhuǎn)化相關(guān)酶活性和微生物代謝活性 (圖8)[8–9]。與之對應(yīng)，磷肥的施用增加了土壤基礎(chǔ)呼吸強度，降低了微生物代謝熵值 (圖9)[9]。缺失磷肥的Control代謝熵最高，說明微生物代謝受到嚴重的缺磷脅迫。此外，衡量土壤微生物活性的單個細胞熱散逸量 (QT/N0) 也顯示Control碳排放顯著高于含磷施肥 (圖10)[7]。以上結(jié)果一致表明磷肥施用能夠使潮土中微生物更“高效低排”地進行碳素轉(zhuǎn)化。

表 2 長期施肥潮土土壤理化性質(zhì)的影響Table 2 Effects of long-term fertilization on physical and chemical nature in fluvo-aquic soil under different fertilizations

圖7 添加葡萄糖和硫酸銨 (a) 和添加葡萄糖、硫酸銨和添加 (或不添加) 磷酸二氫鈉 (b) 后不同施肥處理潮土土壤微生物代謝熱動力學曲線Fig. 7 Power-time curves recorded microcalorimetry from soil samples amended with (a) glucose and ammonium sulphate and (b) glucose and ammonium sulphate, with or without sodium dihydrogen phosphate in fluvo-aquic soil under different fertilizations

圖8 不同施肥處理下潮土微生物生物量碳、轉(zhuǎn)化酶與脫氫酶活性及微生物代謝活力的比較Fig. 8 Soil microbial biomass C, invertase activity, dehydrogenase activity, dehydrogenase activity per biomass C in fluvoaquic soil under different fertilizations

圖9 不同施肥處理下潮土基礎(chǔ)呼吸強度(a) 與微生物代謝熵 (b) 的比較Fig. 9 Soil basal respiration (a) and metabolic quotient (b) in fluvo-aquic soil under different fertilizations

該部分研究內(nèi)容說明對于缺磷潮土，磷肥施用能夠提高微生物生物量碳、轉(zhuǎn)化酶活性、呼吸強度及微生物碳代謝活性，且土壤微生物代謝熵與代謝熱顯著降低，使之能夠保障潮土養(yǎng)分轉(zhuǎn)化與作物養(yǎng)分吸收，增加潮土綜合碳匯效應(yīng)，“高效低排”地為生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)；相反，不施磷肥條件下，土壤微生物不僅代謝效率低下，而且代謝過程會散逸相對多的熱量、排放相對多的CO2，不利于潮土碳累積，導致潮土質(zhì)量明顯下降。

3 磷肥施用對潮土氮轉(zhuǎn)化微生物學特性的影響

氮素是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)最重要的養(yǎng)分之一，它對作物和微生物的生長，以及生態(tài)功能的發(fā)揮都有重要的作用。土壤微生物是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)氮素轉(zhuǎn)化的驅(qū)動者。如前文所述，土壤中碳、氮、磷循環(huán)是一個有機的整體，磷素盈虧對潮土碳循環(huán)過程及其微生物都有顯著影響，因此也必將影響氮循環(huán)相關(guān)微生物的多樣性和功能，進而改變潮土氮轉(zhuǎn)化過程。而這些過程的改變也必將反映于潮土碳循環(huán)和土壤肥力上。

圖10 不同施肥處理下潮土微生物單個細胞的熱散逸量Fig. 10 The heat output per cell unit (QT/N0) in fluvo-aquic soil under different fertilizations

在封丘潮土農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分平衡長期定位施肥試驗運行近20年后，不同施肥處理土壤的總氮含量如圖11所示。含磷施肥OM、1/2OMN、NPK和NP處理土壤全氮含量顯著高于缺磷的NK和Control處理[10]。與1989年長期試驗開始時的土壤全氮含量相比，經(jīng)過18年，OM、1/2OMN、NPK和NP處理顯著增加了土壤全氮含量 (表3)，但是不施磷肥的NK處理，盡管長期向土壤中施入氮肥，土壤全氮含量與長期不施肥對照 (Control) 相似，均低于18年前，降幅達8.8% (表3)?？赡艿脑颍阂皇怯捎谌绷讎乐匾种屏顺蓖辽献魑锏纳L，導致大量的無機氮存留于潮土中，加劇了其他形式氮的損失，尤其是氣態(tài)氮損失，如氨揮發(fā)、氧化亞氮排放等，從而導致嚴重的氮素分餾效應(yīng) (圖11)；二是由于土壤碳氮比基本不變，缺磷不利于潮土碳的積累，也同時會影響到土壤中氮素的截留。因此從氮素高效利用和環(huán)境保護角度出發(fā)，對于缺磷潮土，必須在施用氮肥的基礎(chǔ)上合理地添加磷肥才能更好促進作物生長和減少氮素損失。

為了揭示不同施肥處理下潮土氮素轉(zhuǎn)化過程差異的微生物學機制，我們對土壤脲酶和微生物生物量氮進行了分析 (圖12)[11]。施用磷肥增加了潮土有機氮的輸入，促進了潮土微生物生長進而提高了微生物生物量氮與脲酶活性，而缺磷處理的作用均沒有達到顯著水平。尤為關(guān)注的是，不施磷肥的NK處理不僅脲酶活性未顯著提高 (圖12a)，微生物生物量氮甚至趨于下降 (圖12b)。該現(xiàn)象和表3中NK處理土壤全氮含量下降相一致，也說明在缺磷土壤中，必須在施用氮肥的基礎(chǔ)上合理添加磷肥才能更好地促進土壤微生物的作用及微生物驅(qū)動的氮素循環(huán)過程。

圖11 長期不同施肥對潮土全氮及其15N豐度的影響Fig. 11 Total N contents and δ15N of soils in fluvo-aquic soil under long-term different fertilizations

表 3 長期施肥潮土全氮含量與試驗開始時比較Table 3 Total N content compared with the beginning of the test in fluvo-aquic soil under long-term different fertilizations

該部分研究表明，必須在施用氮肥的基礎(chǔ)上添加磷素才能改善潮土氮素循環(huán)微生物活性和促進潮土供氮能力。如果不補充磷肥，長期施用氮肥不僅不能促產(chǎn)增效，還會加劇環(huán)境的污染。因此，對于潮土，科學施用氮肥的前提是合理地添加磷肥，才能更好地促進作物生長、減少環(huán)境污染和提升土壤肥力。這些發(fā)現(xiàn)有助于指導科學施肥，有效提高華北平原氮肥利用率和增產(chǎn)效果，同時也可緩解農(nóng)田氮素損失及其對環(huán)境的壓力。

圖12 長期不同施肥對潮土脲酶活性 (a) 與土壤微生物生物量氮 (b) 的影響Fig. 12 Effects of long-term fertilization on fluvo-aquic soil urease activity (a) and soil microbial biomass (b)

4 潮土碳磷耦合的微生物學機制研究

前面的研究發(fā)現(xiàn)磷素缺乏使得潮土有機碳難以累積。微生物是土壤碳累積的關(guān)鍵因子，通過揭示缺磷潮土微生物學特性有助于揭示其中的機理。此外，由于有機碳是土壤養(yǎng)分循環(huán)的源動力，我們設(shè)想外源碳的投入可以通過微生物增殖而活化潮土磷素。因此，我們選擇典型豐磷 (NPK) 和缺磷處理(NK) 的潮土，研究潮土缺磷對碳轉(zhuǎn)化相關(guān)微生物的影響，以及添加外源碳對潮土磷素及其相關(guān)微生物的影響[12]。分別在缺磷和豐磷潮土中添加外源葡萄糖，測定70天內(nèi)CO2排放量，微生物數(shù)量、多樣性和群落結(jié)構(gòu)變化，計算外源碳的截留、有效態(tài)磷含量。結(jié)果表明，缺磷潮土本底碳礦化速率顯著低于豐磷土壤處理 (圖13a)，即缺磷顯著降低土壤基礎(chǔ)呼吸。但是葡萄糖凈礦化結(jié)果卻相反 (圖13b)，即缺磷土壤中有更多的外源碳被礦化[12]。

外源碳的添加對土壤微生物豐度和多樣性均產(chǎn)生了影響。添加葡萄糖可以促進兩種磷含量潮土中微生物的增殖，但缺磷土壤中微生物生物量低于豐磷土壤 (圖14)[12]。多樣性指數(shù)響應(yīng)上兩個處理也存在差異。添加葡萄糖兩天后，豐磷土壤處理中微生物多樣性下降得更多；70天后，缺磷土壤多樣性恢復至起始狀態(tài)，豐磷土壤雖有恢復但依然低于起始狀態(tài)。

圖13 CO2-C累積排放量(a) 和累積凈礦化量 (b)Fig. 13 Cumulative CO2 emissions from incubated soils and net C mineralization from added glucose

主成分分析結(jié)果清楚地顯示了細菌群落結(jié)構(gòu)對葡萄糖刺激和磷有效性的響應(yīng)。在三個采樣時期，缺磷土壤微生物群落結(jié)構(gòu)均顯著不同于豐磷土壤處理，且70天的群落差異最大 (圖15)[12]。此外，無論缺磷還是豐磷條件下，葡萄糖對微生物群落的影響都極其顯著。群落最大的變異發(fā)生在0天和2天之間，70天后差異有所減小。該結(jié)果說明葡萄糖的添加迅速刺激微生物，導致微生物群落的巨大改變，而葡萄糖逐漸消耗完之后，群落結(jié)構(gòu)趨向于回復到初始的狀態(tài)。但是即使經(jīng)過70天的培養(yǎng)，微生物群落依然與初始狀態(tài)有顯著不同。微生物群落結(jié)構(gòu)在缺磷土壤中的恢復比豐磷土壤更為強烈。

圖14 添加葡萄糖培養(yǎng)0天、2天和70天后的細菌16S rRNA基因拷貝數(shù)(a) 和Simpson指數(shù) (b)Fig. 14 Bacterial 16S rRNA gene copy number (a) and Simpson index (b) of incubated soils at 0, 2 and 70 days after glucose addition

對初始狀態(tài)土壤和添加葡萄糖培養(yǎng)70天的土壤進行了微量熱分析 (圖16)[12]，發(fā)現(xiàn)缺磷顯著抑制土壤微生物的活性。添加葡萄糖均顯著刺激微生物的代謝活性，且缺磷土壤表現(xiàn)尤其明顯，并且葡萄糖對其微生物的刺激作用至少可維持70天。該現(xiàn)象揭示葡萄糖的刺激作用復蘇了缺磷土壤中微生物的代謝活性，可以長效緩解土壤缺磷對微生物活性的抑制。

圖15 添加葡萄糖培養(yǎng)0天、2天和70天土壤微生物群落結(jié)構(gòu)主成分分析Fig. 15 Principal component analysis (PCA) of the soil bacteria community at 0, 2 and 70 days after glucose addition

進一步對土壤有效磷和微生物生物量磷進行分析。在三個采樣時間點，缺磷土壤有效磷含量都顯著低于豐磷土壤 (圖17)[12]。添加葡萄糖后，有效磷含量迅速降低，而微生物生物量磷在葡萄糖添加兩天后顯著增加，在缺磷和豐磷土壤中分別提高245%和232%。第70天后，微生物生物量磷雖與第2天相比有所降低，但依然高于初始土壤，該現(xiàn)象在缺磷土壤中尤為明顯。假設(shè)土壤有效磷和微生物生物量磷之和為土壤潛在有效性磷，那么葡萄糖的刺激作用顯著增加了土壤潛在有效磷含量，且這種刺激作用在缺磷土壤中更為明顯。

圖16 添加葡萄糖培養(yǎng)0天、2天和70天的微量熱曲線Fig. 16 Power-time curves of incubated soils at 0 and 70 days after glucose addition

圖17 添加葡萄糖培養(yǎng)0天、2天和70天后各處理中有效磷和估計生物量磷含量Fig. 17 Soil available P (AP) content and estimated microbial biomass P (MP) at 0 d, 2 d and 70 d after glucose addition

微生物群落結(jié)構(gòu)和功能變化的根源在于關(guān)鍵物種的響應(yīng)。初始狀態(tài)，在缺磷和豐磷土壤中主要微生物類群分布在變形菌門、酸桿菌門、擬桿菌門和厚壁菌門。在豐磷土壤中主導群落變異的微生物主要是Bacillus屬 (圖18，A1)；在缺磷土壤中，四類主要微生物 (Paenibacillus屬、Comamonadaceae科、Rhizobiaceae科、Pseudomonas屬) 在添加葡萄糖后大幅度增加 (圖18，A2)[12]。這四類微生物都被報道具有解磷功能，它們在受到外源碳的刺激進行增殖后，有助于土壤磷素的活化。

為了驗證解磷微生物在外源碳刺激下是否被活化，我們結(jié)合BIOLOG和微量熱兩種技術(shù)來研究缺磷潮土中解磷微生物對碳源的響應(yīng)[13]。利用BIOLOG技術(shù)找到缺磷 (Control) 和豐磷 (OM) 土壤間微生物代謝能力發(fā)生分異的3種關(guān)鍵碳源，L-精氨酸，糖原，α-D-乳糖(表4)[13]。將該3種碳源分別加入缺磷和豐磷土壤中，在缺磷土壤中添加糖原能顯著提高微生物代謝活性，起到與補磷相似的效果 (圖19a)，而在豐磷土壤中，糖原處理與葡萄糖處理的熱動力學曲線重合度較高 (圖19b)。糖原提高土壤微生物代謝活性的原因為它是一類解磷微生物 (phosphateaccumulating organisms，PAOs) 的碳源及能源物質(zhì)[14]。糖原的添加可以刺激PAOs將不可利用態(tài)的磷轉(zhuǎn)化為生物可利用態(tài)，即提高了磷素的有效性。該結(jié)果證實了前面的研究，明確了添加外源碳能夠刺激解磷微生物的功能，提高土壤潛在有效磷含量，達到添加磷素的效果。

本研究結(jié)果表明，長期缺磷使得外源碳經(jīng)由微生物轉(zhuǎn)化進入土壤有機碳庫的比例少，即外源碳消耗比例高，不利于潮土對碳的積累，更多的碳會以CO2的形式進入大氣。但是，外源碳的添加能夠長效刺激缺磷土壤中微生物的增殖，特別是刺激解磷微生物的代謝和生長。該過程可以使土壤化學固持的磷素轉(zhuǎn)移到微生物體內(nèi)，增加了土壤中潛在有效磷含量，后續(xù)可以提供給植物利用。綜上所述，我們提出了潮土微生物驅(qū)動的碳磷交互初步設(shè)想：缺磷使得潮土微生物會消耗更多的外源性碳，即“缺磷耗碳”；向缺磷潮土中添加碳源物質(zhì)，可以加速微生物周轉(zhuǎn)，激活磷素循環(huán)的關(guān)鍵微生物物種，提高土壤磷的有效性，達到“增碳活磷”的效果。

5 研究展望

土壤碳、氮、磷、硫、鐵等關(guān)鍵元素的生物地球化學循環(huán)過程、耦合機理及驅(qū)動機制研究是土壤生物學研究的核心之一。解析土壤養(yǎng)分耦合循環(huán)的微生物驅(qū)動機制，不僅是深入理解土壤基本生態(tài)過程 (如土壤有機質(zhì)的分解與積累、土壤硝化反硝化過程) 的重要突破口，也是指導科學施肥提高農(nóng)田地力的理論基礎(chǔ)。這給我們提出更高要求的科學目標和任務(wù)，激勵我們?nèi)?yīng)對和挑戰(zhàn)。

第一，土壤微生物理論體系需擴容。亟需在更高的層面來總結(jié)當前實驗科學的認知。技術(shù)和方法的進步使得農(nóng)田土壤微生物的研究試驗取得了豐富的結(jié)果，這些發(fā)現(xiàn)還只是“管中窺豹”，比較零星化和碎片化，并且有些發(fā)現(xiàn)已經(jīng)突破了之前的理論，需要一個更高的理論框架來綜合和提升，例如科學施肥下農(nóng)田土壤微生物群落的構(gòu)建機制，物種間的交互機制和核心物種的進化機制，從熱動力學平衡來解析物質(zhì)轉(zhuǎn)化 (或元素間電子傳遞) 的微生物學過程。這就需要我們引入其他學科，如群落生態(tài)學、進化生物學和物理化學等的理論，借鑒這些學科已有的理論基礎(chǔ)，構(gòu)建新的理論框架，并利用新的理論體系更全面地揭示微生物在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，特別是在農(nóng)田土壤養(yǎng)分耦合循環(huán)中的重要作用。

第二，對土壤微生物介導的養(yǎng)分循環(huán)耦合性的認識需深化。農(nóng)田土壤養(yǎng)分循環(huán)耦合性雖逐步受到重視，但仍處于起步階段，更多工作需要細化和深化。今后應(yīng)關(guān)注不同土壤類型異同性和多種元素循環(huán)過程間的耦合性和整體性；在關(guān)注碳氮磷等主要元素的同時，也需關(guān)注微量元素；關(guān)注元素耦合間的電子傳遞過程；關(guān)注元素耦合代謝的新途徑以及發(fā)掘關(guān)鍵微生物物種和專性基因等；闡明同一營養(yǎng)層內(nèi)和不同營養(yǎng)層間微生物互作與養(yǎng)分循環(huán)耦合性的驅(qū)動機制；揭示地上–地下協(xié)同作用對養(yǎng)分生物有效性的影響與互饋，最終達到通過定向調(diào)控微生物群落結(jié)構(gòu)和功能，增加養(yǎng)分固持和持續(xù)供應(yīng)能力，提高養(yǎng)分利用率。

圖19 缺磷 (Control)(a) 和豐磷 (OM)(b) 潮土的微量熱代謝圖譜Fig. 19 Power-time curve profiles for control (a) and OM soils (b)

第三，土壤微生物研究方法學需提升。學科的發(fā)展一直依賴于研究方法的改進和突破。近年來，土壤微生物學研究領(lǐng)域的迅猛發(fā)展得益于分子生態(tài)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，但是相對于其他學科研究，土壤微生物研究方法仍相對落后。這需要我們繼續(xù)借鑒生態(tài)、物理、化學、數(shù)學、計算機和工程等領(lǐng)域的先進技術(shù)和理念，拓展產(chǎn)生新的微生物研究方法與技術(shù)。今后應(yīng)采用多種微生物組學研究的新技術(shù)和新方法，研究農(nóng)田養(yǎng)分耦合循環(huán)的微生物多樣性、群落結(jié)構(gòu)、進化關(guān)系及與環(huán)境間相互作用關(guān)系；建立土壤養(yǎng)分耦合循環(huán)的微生物學評價技術(shù)和指標，以及完備的土壤微生物研究數(shù)據(jù)庫服務(wù)云平臺；在常規(guī)篩選菌種資源的基礎(chǔ)上，關(guān)注高通量篩分篩選等新技術(shù)，在基因水平和細胞水平上提高篩選的成功率和菌種資源的獲得率，以建立土壤養(yǎng)分耦合循環(huán)的關(guān)鍵微生物種的資源庫和基因庫。

第四，長期試驗平臺建設(shè)需重視。農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中很多生態(tài)過程的進展相當緩慢，短期試驗不能揭示生態(tài)過程的變化趨勢。只有持續(xù)穩(wěn)定的長期定位試驗才能揭示生態(tài)過程的演變機制，促進生態(tài)學理論的發(fā)展，提供科學合理的施肥參數(shù)和資源優(yōu)化管理。因此，我們必須重視長期試驗平臺的建設(shè)和維護。

致謝:特別感謝中國科學院封丘農(nóng)業(yè)生態(tài)試驗站對本課題組工作的大力支持！感謝本課題組胡君利副研究員和王俊華實驗師，青島科技大學王發(fā)園教授，南京信息工程大學徐江兵老師在此工作中做出的貢獻。

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Research progresses of soil microorganisms driven nutrient coupling cycles in fluvo-aquic soils of China

LIN Xian-gui, FENG You-zhi, CHEN Rui-rui
( State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture/Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China )

Scientific fertilization is a pivotal step towards sustainable increase of crop yield without the expense of agroecosystem health. The knowledge on the process of nutrient cycle driven by soil microbes is of great help to evaluate and guide scientific fertilizations. Although mounting investigations had been conducted on the influences of fertilization strategies on soil microorganisms in recent years, they are mainly limited to the cycling of single nutrient involved into soil microorganisms. In view of the integrity and inseparability of nutrients cycling, the related knowledge on their interaction and coordination with microbial processes would greatly contribute to the comprehensive understanding of the influences that fertilizations bring to agroecosystem.Therefore, revealing the nutrients cycling mediated by soil microorganisms will help us to understand the soilnutrient cycling process and guide scientific fertilization. This paper reviews the findings of the group of Prof.Xiangui Lin, in Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences. Based on a long-term fertilizer experiment located in Fengqiu Agro-Ecological Experimental Station, they have systematically investigated carbon (C), nitrogen (N), phosphorus (P) nutrients cycling and their interactions in association with microbial processes, using soil microbiology, molecular ecology, microcalorimetric and isotopic determination technique,etc. The results indicated that the fluvo-aquic soil is mainly limited by phosphorous. Application of phosphorous fertilizers enhanced microbial biomass carbon content, invertase activity, urease activity, respiration rate and microbial metabolic activity in the soil, which could ensure nutrient transformation in the soil and nutrient uptake of crop, as a result increasing sink effects of carbon and nitrogen. On the contrary, if phosphorus fertilization is deficient, even with application of other nutrients such as nitrogen, soil microbial metabolic efficiency still remains low. More carbon and nitrogen will be lost by microbial metabolic processes, which are not conducive to soil carbon and nitrogen accumulation, consequently leading to poor soil quality and intensified environmental pollution. In addition to the response and feedback of soil microorganisms to nutrients in fluvo-aquic soil, this paper further reveals the microbial mechanisms of the coupling of carbon and phosphorus, and summarizes as“P deficiency leads to C consumption, C supply results in P activation”. Long-term P deficiency significantly increased the net mineralization of exogenous carbon, which reduced the retention of exogenous C into the soil organic carbon pool mediated by microbial transformation, possibly due to a higher C loss into the atmosphere in the form of CO2. The addition of exogenous C could stimulate microbial proliferation in P-deficient soils, especially P solubilizing microorganisms. The process can shift P from relatively unavailable soil-bound pools into microbial biomass pools through pool cycling; potentially increase soil available P content for crops. Finally, this review looks forward to the future of soil nutrients cycling mediated by soil microorganisms in cropland. These cognitions will deepen the understanding of scientific fertilization and help to guide the regulation of soil microorganisms and better serve the farmland ecosystem.

fertilization; soil; microorganisms; nutrient coupling cylces

2017–07–20 接受日期：2017–08–15

國家自然科學基金（41071168）資助。

林先貴（1955—），男，廣東汕頭人，研究員，主要從事土壤微生物多樣性與生態(tài)功能研究。Tel：025-86881589；E-mail：xglin@issas.ac.cn