食品總鉻質(zhì)量濃度icELISA試劑盒的研制及初步應(yīng)用

王亞楠,王曉斐,張雅凌,張海棠,王自良(1.河南科技學(xué)院 動物科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 4500; 2.動物病毒病防控與藥殘分析 河南省高校重點學(xué)科開放實驗室，河南新鄉(xiāng) 4500; .河南科技學(xué)院 新科學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 4500)

食品總鉻質(zhì)量濃度icELISA試劑盒的研制及初步應(yīng)用

王亞楠1,2,王曉斐3,張雅凌1,2,張海棠1,2,王自良1,2
(1.河南科技學(xué)院 動物科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003; 2.動物病毒病防控與藥殘分析 河南省高校重點學(xué)科開放實驗室，河南新鄉(xiāng) 453003; 3.河南科技學(xué)院 新科學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003)

為研制食品中總鉻質(zhì)量濃度檢測間接競爭ELISA(icELISA)試劑盒(Cr-Kit)。利用蛋白質(zhì)連接技術(shù)合成免疫原Cr3+-iEDTA-BSA，紫外掃描(UV)和電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(ICP-AES)進行鑒定；用Cr3+-iEDTA-BSA免疫BALB/c小鼠，細胞融合技術(shù)篩選抗Cr3+-EDTA mAb細胞株，體內(nèi)誘生腹水法制備Cr3+-EDTA mAb，并對其特性進行分析；應(yīng)用Cr3+-EDTA mAb研制Cr-Kit，測定其性能并進行初步應(yīng)用。結(jié)果表明，免疫原制備成功，Cr3+-iEDTA-BSA中Cr3+和BSA的質(zhì)量濃度分別為140.8 mg/L和5.81 g/L；篩選出2A3C11、2A3D9、2A11G5共3株雜交瘤細胞株，其中2A11G5最好，經(jīng)6次傳代分泌抗體穩(wěn)定，親和常數(shù)(Ka)為2.69×109L/mol，與其他重金屬離子無交叉反應(yīng)；Cr-Kit 標準曲線的線性范圍為1.0～264 μg/L，檢測限為1.0 μg/L，IC50為8.37 μg/L，河水樣、大米樣、面粉樣和豬肉樣的平均加標回收率分別為101.7%、96.47%、95.8%和84.3%，Cr-Kit與國標(GB5009.123-2014)石墨爐原子吸收光譜法(GFAAS)的符合率為100%。本研究成功研制了Cr-Kit，可滿足食品總鉻殘留的檢測要求。

Cr3+；免疫原；單克隆抗體；間接競爭ELISA試劑盒；總鉻質(zhì)量濃度

重金屬鉻(Chromium，Cr)作為一種重要的現(xiàn)代工業(yè)戰(zhàn)略資源，廣泛應(yīng)用于冶金、耐火、化工和國防等領(lǐng)域，由于濫用和缺乏相應(yīng)保護措施，對環(huán)境與食品的污染日趨加重。國家環(huán)境保護部和國土資源部2014年4月聯(lián)合發(fā)布的《全國土壤污染調(diào)查公報》顯示，在81塊工業(yè)廢棄地的775個土壤樣品中，鉻作為主要污染物超標34.9%[1]。2014年9月，發(fā)生在浙江省的“毒膠囊”事件，鉻超標65倍，再次引發(fā)政府和社會對鉻污染超標的的廣泛關(guān)注。由于鉻對人體肝臟[2]、腎臟[2]、遺傳[3]、神經(jīng)[4]具有多種毒性和致癌[5]等作用，尤其是Cr6+是Cr3+毒性的100倍[6]，被列為對人體危害最大的8種化學(xué)物質(zhì)之一，是國際公認的3種致癌的金屬毒物之一。中國為了嚴格控制鉻對食品的污染，衛(wèi)生部發(fā)布了《GB 2762-2011食品中污染物限量標準》，鉻限量標準為水產(chǎn)動物及其制品≤2.0 mg/kg，谷物及其制品≤1.5 mg/kg，蔬菜及其制品≤0.5 mg/kg，豆類及其制品≤1.0 mg/kg，肉及肉制品≤1.0 mg/kg。

目前，國內(nèi)外對鉻離子檢測主要采用石墨爐原子吸收光譜法[7]、火焰原子吸收光譜法[8]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[9]、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法[10]等，這些方法雖然精密度高，但也存在儀器昂貴、技術(shù)要求高、樣品前處理復(fù)雜、檢測成本高、不能現(xiàn)場檢測等缺陷。酶聯(lián)免疫分析(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒是近年發(fā)展起來的成熟先進的檢測方法，具有檢測快速、靈敏度高、選擇性強、費用低廉和可現(xiàn)場操作等優(yōu)點。國外Sasaki等[11]研制出鉻離子免疫檢測器，檢測限達到1.6 μg/L，國內(nèi)Liu等[12]研究報道鉻離子膠體金免疫層析試紙條，檢測限為50 μg/L，而有關(guān)ELISA試劑盒產(chǎn)品研制尚未見報道。本研究旨在制備親和力高、識別能力強、抗Cr3+與EDTA螯合物的單克隆抗體(Cr3+-EDTA mAb)，研制食品總鉻污染殘留檢測間接競爭ELISA(icELISA)試劑盒(Cr-Kit)，以滿足食品行業(yè)對總鉻殘留的檢測要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 動物與細胞 SPF級4周齡雌性BALB/c小鼠5只，試驗編號為M1～M5，由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，動物許可號：SCXK(豫)2010-0002。鼠源骨髓瘤細胞NS0，由農(nóng)業(yè)部動物免疫學(xué)重點實驗室提供。

1.1.2 試劑與溶液 重金屬氯化鉻、氯化鎘、氯化汞、氯化鋁、硫酸銅、硫酸鐵、硫酸錳、硝酸鉛、硝酸鋅標準品，購自鄭州大學(xué)耐火材料研究所，均為AR級；免疫原Cr3+-iEDTA-BSA、包被原Cr3+-iEDTA-OVA均由筆者所在課題組制備；弗氏完全佐劑(CFA)、弗氏不完全佐劑(IFA)，Roche產(chǎn)品；聚乙二醇1500(PEG1500)、細胞培養(yǎng)基RPMI-1640、HAT、HT、胎牛血清(FBS)，Gibco產(chǎn)品；過氧化脲、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)，美國Sigma產(chǎn)品；兔抗鼠酶標二抗(RaMIgG-HRP)，美國Promega產(chǎn)品；試驗用水，去離子水，河南科技學(xué)院化工實驗室制備；ELISA所用洗液(PBST)，0.01 mol/L、pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)含質(zhì)量分數(shù)0.05%Tween-20；包被液，0.1 mol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液(CBS)；封閉液、稀釋液，含體積分數(shù)5%豬血清的PBST；酶底物，TMB磷酸-檸檬酸緩沖液；終止液，2 mol/L硫酸溶液。

1.1.3 儀器 UV-2450紫外分光光度計，日本島津公司；Pharmacia蛋白質(zhì)核酸分析儀，Amersham公司；酶標儀，Thermo公司；PE-AA600 石墨爐原子吸收光譜儀(GFAAS)，Optima-2100DV型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-AES)，美國PerkinElmer公司。

1.2 方 法

1.2.1 人工免疫原合成 參照Kuang等[13]所述的異硫氰酯法加以改進，合成免疫原Cr3+-iEDTA-BSA，如圖1所示。同法合成包被原Cr3+-iEDTA-OVA。

圖1 免疫原Cr3+-iEDTA-BSA合成路線Fig.1 Synthesis scheme of immunogen Cr3+-iEDTA-BSA

1.2.2 人工免疫原鑒定 (1)紫外掃描鑒定。用Hepes溶液配置質(zhì)量濃度為1 mg/mL BSA溶液和載體蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL的Cr3+-iEDTA-BSA溶液，在220～500 nm波長下進行紫外掃描。(2)BSA與Cr3+質(zhì)量濃度測定。用Hepes溶液將Cr3+-iEDTA-BSA倍比稀釋，用核酸蛋白分析儀在278 nm波長下測定Cr3+-iEDTA-BSA中BSA的質(zhì)量濃度，用ICP-AES測定Cr3+的質(zhì)量濃度。

1.2.3 Cr3+-EDTA mAb制備 (1)選擇細胞融合小鼠。用Cr3+-iEDTA-BSA按正常程序免疫5周齡雌性Balb/C小鼠5只，免疫5次，間隔4周，最后1次免疫后第21天斷尾采血分離血清，間接ELISA檢測血清抗體效價，阻斷ELISA檢測其抑制效價，選擇效價<1∶(1.6×103)且抑制效價最低的小鼠用于細胞融合。(2)細胞融合與雜交瘤細胞株的篩選。按常規(guī)方法將免疫脾細胞與NS0瘤細胞以1∶10比例混合，在500 mL/L PEG-1500作用下進行融合、篩選和克隆化，待確定雜交瘤細胞已單克隆化，用間接ELISA和間接競爭ELISA進行陽性雜交瘤細胞篩選，建立細胞株，凍存于液氮備用。(3)Cr3+-EDTA mAb制備。體內(nèi)誘生腹水法制備Cr3+-EDTA mAb，選擇經(jīng)產(chǎn)雌性BALB/c小鼠5只，腹腔注射IFA 1 mL，12 d后腹腔注射雜交瘤細胞1×106個/只，10 d后待小鼠腹部明顯膨大即可收集腹水，飽和硫酸鹽法進行純化。

1.2.4 Cr3+-EDTA mAb特性分析 (1)穩(wěn)定性分析。將凍存的雜交瘤細胞，每間隔10 d復(fù)蘇并傳代1次，共傳代6次，每次傳代用間接ELISA檢測不同代次細胞培養(yǎng)上清中抗體效價情況，以測定雜交瘤細胞分泌抗體的穩(wěn)定性。(2)親和性分析。按照Kim等[14]所述Batty飽和法測定親和常數(shù)(Ka)，按下式①進行計算。(3)特異性分析。間接競爭ELISA測定Cr3+-EDTA mAb對Cd2+、Hg2+、Al3+、Cu2+、Fe3+、Mn2+、Pb2+、Zn2+等金屬離子與EDTA的螯合物及EDTA的交叉反應(yīng)率，按下式②進行計算。

Ka=(n-1)/[2(n[Ab]t-[Ab]t)]

①

CR=P/P1×100%

②

式中：CR為交叉反應(yīng)率；P為Cr3+-EDTA mAb對Cr3+-EDTA的IC50；P1為Cr3+-EDTA mAb對其他金屬離子與EDTA螯合物及EDTA的IC50。

1.2.5 Cr-Kit的研制 (1)Cr3+-iEDTA-OVA、Cr3+-EDTA mAb和RaMIgG-HRP最佳工作濃度的確定。采用方陣法[15]。(2)Cr-Kit組裝及配套試劑配置。包被酶標板，用CBS稀釋工作濃度的Cr3+-iEDTA-OVA，100 μL/孔，37 ℃溫育2 h，PBST洗板6次；封閉酶標板，封閉液250 μL/孔，37 ℃溫育1 h，PBST洗板6次，拍干，鋁箔袋密封，保存?zhèn)溆谩Ｅ涮自噭┡渲冒–r3+-iEDTA-OVA包被并封閉好的8×12孔酶標板(1塊)，C1號液(工作濃度Cr3+-EDTA mAb 6 mL)，C2號液(工作濃度RaMIgG-HRP 6 mL)，C3、C4號液(底物緩沖液A、B各6 mL)，C5號液(終止液6 mL)，Cr3+-EDTA標準溶液(用PBS配置終質(zhì)量濃度分別為0.0、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0和160.0 μg/L的Cr3+-EDTA標準溶液各0.5 mL)，PBST等；(3)Cr-Kit操作步驟。第一步，加入工作濃度的Cr3+-EDTA mAb 50 μL/孔，設(shè)陽性和陰性對照，37 ℃溫育20 min，PBST洗板6次；第二步，加入工作濃度的RaMIgG-HRP 50 μL/孔，同時等體積加入Cr3+-EDTA標準品(質(zhì)量濃度分別為0.0、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0和160.0 μg/L)，37 ℃溫育30 min，PBST洗板6次；第三步，加酶底物緩沖液，100 μL/孔，室溫顯色5 min；第四步，加終止液，100 μL/孔，讀A450值。(4)Cr-Kit標準工作曲線的建立。按上述Cr-Kit操作步驟測定，以B/B0值(B為不同質(zhì)量濃度標準溶液的A450值，B0為空白溶液的A450值)為縱坐標，以不同質(zhì)量濃度(0.0、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0和160.0 μg/L)標準溶液的常用對數(shù)值為橫坐標，繪制標準曲線，推導(dǎo)回歸方程。(5)Cr3+-EDTA標準品制備與待測樣品預(yù)處理。取等體積的Cr3+標準品溶液(1 000 μg/L)與EDTA(1 mol/L)混合，靜置10 min，用PBS稀釋成所需濃度；液體樣品如水樣、尿樣、血液樣、牛奶樣等，在樣品中加入10%濃度為0.1 mol/L的EDTA鰲合劑，混合反應(yīng)30 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液進行檢測；固體樣品如土壤樣、大米樣、面粉樣、組織樣等，稱取1.0 g樣品于100 mL錐形瓶內(nèi)，加入1 mL雙蒸水浸潤后加入混酸溶液6 mL(3 mL濃H3PO4和3 mL濃H2SO4)，蓋上表面皿，置于電爐上加熱至冒白煙，冷卻后加入0.5 mL濃HNO3，繼續(xù)加熱至樣品變白色、消解液呈黃綠色，用雙蒸水沖洗，全部轉(zhuǎn)移入50 mL離心管內(nèi)，5 000 r/min離心10 min，將上清液移入100 mL容量瓶中，加入10 mL濃度為1 mol/L、pH 9.5的Na2SO3溶液，攪拌反應(yīng)1 h，之后加入10 mL濃度為0.1 mol/L的EDTA鰲合劑溶液，攪拌反應(yīng)8 h，定容至100 mL，得到樣品檢測溶液。

1.2.6 Cr-Kit的性能測定 (1)檢測限與穩(wěn)定性。用Cr-Kit進行測定，以Cr-Kit對Cr3+-EDTA的IC15為檢測限[16]。將同一批組裝的Cr-Kit避光保存于4 ℃冰箱，分別于0、45、90、135、180和225 d測定繪制曲線并與標準曲線比較，確定穩(wěn)定性。(2)準確性與精密性。將Cr3+-EDTA標準溶液添加到河水樣、大米樣、面粉樣、豬肉樣，設(shè)置陰性(0 μg/L)和陽性低(2.0 μg/L)、中(10.0 μg/L)和高(50.0 μg/L)4個不同質(zhì)量濃度處理，6個重復(fù)，用Cr-Kit進行測定，以加標回收率和標準差(RSD)確定其準確性；在不同時間段，分別組裝Cr-Kit，分6次對上述加標樣品進行測定，6個重復(fù)，以批內(nèi)RSD和批間RSD確定其精密度。(3)基質(zhì)酸堿效應(yīng)性。調(diào)pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的PBS溶液，用于分別稀釋工作濃度的Cr3+-EDTA mAb和Cr3+-EDTA標準溶液，用Cr-Kit進行測定，研究基質(zhì)不同pH對Cr-Kit的B0值和IC50值的影響，選擇B0值高且穩(wěn)定、IC50值最小為最適pH范圍。

1.2.7 實際應(yīng)用與復(fù)核試驗 課題組分別從河南省鄭州市、新鄉(xiāng)市、焦作市、鶴壁市采集河水樣32份、大米樣30份、面粉樣30份、豬肉樣20份，每種樣品用封閉液2份作陰性對照，用Cr-Kit和國標(GB5009.123-2014)石墨爐原子吸收光譜法(GFAAS)分別進行檢測，測定其符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫原鑒定

紫外掃描結(jié)果見圖2。BSA在278 nm出現(xiàn)特征峰，Cr3+-iEDTA在264、332 nm出現(xiàn)特征峰，Cr3+-iEDTA-BSA在272、332 nm出現(xiàn)特征峰，兼有BSA和Cr3+-iEDTA的特征峰，說明免疫原合成成功。

圖2 BSA、Cr3+-iEDTA和Cr3+-iEDTA-BSA的紫外掃描圖Fig.2 UV spectra of BSA,Cr3+-iEDTA and Cr3+-iEDTA-BSA

BSA與Cr3+質(zhì)量濃度測定結(jié)果表明，Cr3+-ITCBE-BSA中BSA的質(zhì)量濃度為5.81 g/L，ICP-AES測定Cr3+的質(zhì)量濃度為140.8 mg/L，說明免疫原合成成功。

2.2 Cr3+-EDTA mAb制備

細胞融合小鼠選擇結(jié)果見圖3、圖4。5只免疫小鼠多抗血清效價均達到了10-4，且M1效價最高為1∶(5.12×104)，敏感性也最好，IC50最低24.8 μg/L，選M1進行細胞融合。

圖3 抗Cr3+-EDTA pAb效價測定曲線Fig.3 Titer curves of Cr3+-EDTA pAb determined by indirect ELISA

雜交瘤細胞株篩選結(jié)果，融合細胞經(jīng)3次克隆化后陽性率達100%，間接ELISA和阻斷ELISA分別測定其效價和IC50，根據(jù)測定結(jié)果，篩選出3株高效價、敏感的雜交瘤細胞株，分別命名為2A3C11、2A3D9和2A11G5。

圖4 Cr3+-EDTA pAb對Cr3+-EDTA的抑制曲線Fig.4 Inhibitory curves of Cr3+-EDTA pAb against Cr3+-EDTA dermined by blocking ELISA

2.3 Cr3+-EDTA mAb特性分析

2.3.1 雜交瘤穩(wěn)定性分析 結(jié)果見圖5。3株雜交瘤凍存前細胞培養(yǎng)上清效價測定吸收值與6次凍存、復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)后上清效價基本一致，說明3株雜交瘤分泌抗體穩(wěn)定性好。

圖5 細胞傳代培養(yǎng)上清中抗體效價變化Fig.5 Indirect ELISA titer of mAb secreted by hybridomas continually in the supernatants

2.3.2 親和性分析 結(jié)果見圖6。2A3C11、2A3D9、2A11G5的Ka分別為7.85×108L/mol、1.03×109L/mol和2.69×109L/mol，均為高親和力抗體[17]，其中2A11G5親和力最高。

2.3.3 特異性分析 結(jié)果見表1。Cr3+-EDTA mAb對Cr3+-EDTA的IC50為16.6 μg/L，對EDTA及其他金屬離子的IC50均大于103，說明Cr3+-EDTA mAb具有較高的特異性。

圖6 Cr3+-EDTA mAb的Ka測定曲線Fig.6 Association constant curve of Cr3+-EDTA mAb

表1 Cr3+ mAb與EDTA及其他金屬離子的交叉反應(yīng)Table 1 Percent cross-reactivity of Cr3+ mAb with EDTA and other metal ions

2.4 Cr-Kit的研制

方陣法測定Cr3+-iEDTA-OVA、Cr3+-EDTA mAb和RaMIgG-HRP最佳工作質(zhì)量濃度分別為2 μg/mL、1∶(5.12×105)和1∶(1×103)。Cr-Kit標準曲線見圖7，曲線回歸方程為y=-33.379x+80.795，R2為0.987 3，IC50為8.37 μg/L，線性范圍為1.0～264 μg/L。

圖7 Cr3+-EDTA檢測icELISA標準曲線Fig.7 Standard curve of icELISA for detection of Cr3+-EDTA

2.5 Cr-Kit的性能測定

2.5.1 檢測限與穩(wěn)定性測定 Cr-Kit對Cr3+-EDTA的IC15為0.75 μg/L，由于實際檢測工作需要與操作方面存在的誤差，檢測限確定為1.0 μg/L。穩(wěn)定性測定結(jié)果見表2。在0～180 d保存期內(nèi)，檢測限、線性范圍、IC50和R2均無明顯變化，但在225 d時變化顯著，尤其吸光度減小與IC50上升明顯。因此，Cr-Kit的有效保存期為180 d。

表2 Cr-Kit穩(wěn)定性測定Table 2 Measurement stability of Cr-Kit

2.5.2 準確性與精密性測定 結(jié)果見表3。河水樣加標回收率為97.3%～108.4%，平均101.7%，RSD為8.6%～13.9%，平均11.7%；大米樣加標回收率為87.6%～106%，平均96.47%，RSD在8.5%～12.4%，平均103.8%；面粉樣加標回收率為84.9%～108.5%，平均95.8%，RSD為8.7%～13.3%，平均11.1%；豬肉樣加標回收率為78.7%～88%，平均84.3%，RSD為11.3%～13.8%，平均12.7%。陰性樣品的回收率沒有出現(xiàn)，批內(nèi)RSD為9.5%～10.5%，批間RSD為9.7%～0.3%。結(jié)果說明，批內(nèi)與批間不同樣品4個處理間的檢測結(jié)果差異顯著(P<0.05)，批內(nèi)與批間RSD較為穩(wěn)定，差異不顯著(P>0.05)，Cr-Kit能夠滿足總鉻殘留的檢測要求。

2.5.3 基質(zhì)酸堿效應(yīng)性測定 圖8顯示，Cr-Kit受基質(zhì)pH影響較大，在偏酸性基質(zhì)(pH<6.5)時，B0值與IC50明顯增大，影響Cr-Kit的靈敏性；在偏堿性基質(zhì)(pH>8.0)時，B0值與IC50值變化雖不明顯，但也呈上升趨勢，同樣影響到檢測結(jié)果的準確性。因此，選擇B0>1.2、IC50≈8.37 μg/L時pH 6.5～8.0為適宜反應(yīng)條件。

圖8 樣品基質(zhì)pH對B0值和IC50值的影響Fig.8 Effects of pH in sample matrix on B0 value and IC50 value

表3 Cr-Kit準確性與精密性測定Table 3 Measurement accuracy and precision of Cr-Kit

注：“-”表示回收率在該處理下未出現(xiàn)。同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:“-”Not in this treatment. Different lowercase letters in the same column indicate significant difference(P<0.05).

2.5.4 實際應(yīng)用與復(fù)核試驗 從表4可見，在120份樣品中共檢出15份陽性樣品，Cr-Kit與GFAAS的檢測結(jié)果一致，均為15份陽性樣品，符合率為100%；Cr-Kit測定的陽性樣品范圍值為1.8～78.4 μg/L，GFAAS測定的陽性樣品范圍值為1.5～85.1 μg/L，結(jié)果基本一致，RSD較為穩(wěn)定，差異不顯著(P>0.05)；Cr-Kit測定的陰性樣品范圍值為0.11～0.14 μg/L，GFAAS測定的陰性樣品范圍值為0.09～0.15 μg/L，結(jié)果也基本一致，差異不顯著(P>0.05)；陰性樣品與陽性樣品的檢測結(jié)果差異極顯著(P<0.01)。豬肉樣品陽性率高達30%，占陽性樣品總數(shù)的40%，這可能與飼料中添加鉻制劑有關(guān)。

表4 Cr-Kit與GFAAS實際檢測結(jié)果比較Table 4 Real detection results of parallel test of Cr-Kit and GFAAS

3 討 論

3.1 關(guān)于免疫原制備

高質(zhì)量的免疫原是制備高質(zhì)量抗體的基礎(chǔ)，而高質(zhì)量免疫原須具備3個條件，高免疫原性、充分暴露抗原表位和對免疫動物無毒害，但Cr3+結(jié)構(gòu)簡單，無法直接誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性抗體，且所帶電荷能與機體內(nèi)生物分子發(fā)生不可逆反應(yīng)而導(dǎo)致機體中毒。因此，對免疫原制備是本試驗的關(guān)鍵。在重金屬離子人工免疫原制備中偶聯(lián)劑的選擇是核心，必須滿足3個條件，牢固結(jié)合重金屬離子、含有與載體蛋白反應(yīng)的活性基團和偶聯(lián)物能夠被免疫系統(tǒng)充分識別，通過大量篩選對比試驗，大分子雙功能鰲合劑是最為理想的偶聯(lián)劑，目前，常用的大分子雙功能鰲合劑主要包括2類，一是乙二胺四乙酸(EDTA)及其衍生物，二是二乙烯三胺五乙酸(DTPA)及其衍生物。Zhu等[18]和Delehanty等[19]在Cd2+、Pb2+人工免疫原合成中選擇使用二乙烯三胺五乙酸(DTPA)作為偶聯(lián)劑，Liu等[20]在Cu2+、Leopold等[21]在Hg2+人工免疫原合成中選擇使用異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸(iEDTA)，均取得了很好的免疫效果。本試驗選擇ITCBE作為偶聯(lián)劑，Cr3+與ITCBE鰲合后，形成一個穩(wěn)定的六齒狀的配位化合物半抗原，然后再用異硫氰酯法將半抗原偶聯(lián)到BSA上制備成人工免疫原。

3.2 關(guān)于Cr3+-EDTA mAb的質(zhì)量性能

高質(zhì)量的抗體是建立免疫分析方法的核心，抗體質(zhì)量優(yōu)劣主要體現(xiàn)于抗原抗體反應(yīng)的敏感性和特異性兩方面，敏感性是由抗體與其對應(yīng)抗原反應(yīng)的親和力大小所決定的，親和力反映抗體與抗原的結(jié)合強度，以Ka表示，測定Ka的方法有平衡透析法、Scatchard plot法和Batty飽和法等，本試驗采用Batty飽和法，制備的Cr3+-EDTA mAb的Ka為2.69×109L/mol，根據(jù)Velanki等[17]研究結(jié)果，Ka為107～1012L/mol為高親和力抗體，Ka為105～107L/mol為低親和力抗體，本試驗所研制的Cr3+mAb為高親和力抗體。特異性是反映抗體識別抗原的專一性，是由抗體分子超變區(qū)空間結(jié)構(gòu)與抗原決定簇之間的互補性決定的，Alzari等[22]研究證實，抗體識別抗原構(gòu)象型表位的范圍為160～900 ?，Cr3+的晶體構(gòu)象小于3 ?而不被抗體識別[23]，Cr3+-EDTA屬于半抗原，可與抗體發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，抗體識別半抗原的部位是抗體輕鏈超變區(qū)的組氨酸殘基[24]。本試驗采用交叉反應(yīng)試驗鑒定其特異性，所制備的Cr3+mAb可專一識別Cr3+-EDTA，與其他化合物無交叉反應(yīng)性。

3.3 關(guān)于Cr-Kit的質(zhì)量性能

檢測限高低取決于抗體親和力大小，本研究用高親和力抗體建立icELISA檢測方法，設(shè)計組裝Cr-Kit的檢測限為1 μg/L，檢測范圍為1.0～264 μg/L，可滿足國內(nèi)與歐盟食品總鉻殘留限量標準的檢測要求。準確性是由標準曲線標準點的設(shè)置決定的，本研究將標準點設(shè)定為IC15，與Cr3+-EDTA濃度的對數(shù)值設(shè)置在同一條曲線上體現(xiàn)其線性，通過加標回收試驗和實際應(yīng)用證實，所設(shè)標準點線性關(guān)系好，靈敏度高，準確性好。同時，本研究提供了不同檢測樣品的預(yù)處理方法，并優(yōu)化了檢測操作的pH適宜條件。

本研究采用分子交聯(lián)技術(shù)成功合成免疫原Cr3+-iEDTA-BSA，應(yīng)用細胞融合技術(shù)制備出高效價、高親和力、特異性強的Cr3+-EDTA mAb，成功研制了食品總鉻污染殘留檢測icELISA試劑盒，Cr-Kit具有檢測限低、準確性好、特異性強等優(yōu)點，具有廣闊的市場前景和應(yīng)用價值。

Reference：

[1] 李莎莎,孫玉煥.工業(yè)廢棄地鉻污染土壤修復(fù)技術(shù)研究進展探析[J].環(huán)境科學(xué)與管理,2015,40(2):65-69.

LI SH SH,SUN Y H.Research progress on remediation technology of chromium contaminated brownfield soils[J].EnvironmentalScienceandManagement,2015,40(2):65-69(in Chinese with English abstract).

[2] VELMA V,TCHOUNWOU P B.Hexavalent chromium-induced multiple biomarker responses in liver and kidney of goldfish,carassius auratus[J].EnvironmentalToxicology,2011,26(6):649-656.

[3] NICKENS K P,PATIERNO S R,CERYAK S.Chromium genotoxicity:A double-edged sword[J].Chemico-BiologicalInteractions,2010,188(2):276-288.

[4] SCHNEIDE B C,CONSTANT S L,PATIERNO S R,etal.Exposure to particulate hexavalent chromium exacerbates allergic asthma pathology[J].Toxicology&AppliedPharmacology,2012,259(1):38-44.

[5] ZHITKOVICH A. Chromium in drinking water:sources,metabolism,and cancer risks[J].ChemicalResearchinToxicology,2011,24(10):1617-1629.

[6] JAISHANKAR M,TSETEN T,ANBALAGAN N,etal.Toxicity,mechanism and health effects of some heavy metals[J].InterdisciplinaryToxicology,2014,7(2):60-72.

[7] 侯廣順,李英杰,劉瑞恒,等.微波消解-石墨爐原子吸收光譜法測定火山灰中的痕量鉛鉻銅[J].巖礦測試,2015,34(5):539-543.

HOU G SH,LI Y J,LIU R H.Determination of trace lead,chromium and copper in volcanic ash from shinmoe-dake volcano by microwave digestion-graphite furnace atomic absorption spectrometry[J].RockandMineralAnalysis,2015,34(5):539-543(in Chinese with English abstract).

[8] WANG T S,YA Y,HE J,etal.Determination of chromium and zinc in soil by microwave digestion and flame atomic absorption spectrometry[J].AgriculturalScience&Technology,2015,16(9):1962-1964.

[9] 趙子劍,張偉建.電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)測定化妝品中鈹、鉻、砷、鎘、碲、釹、鉈、鉛[J].中國無機分析化學(xué),2015,5(2):9-11.

ZHAO Z J,ZHANG W J.Determination of Be,Cr,As,Cd,Te,Nd,Tl,and Pb in cosmetics by ICP-MS[J].ChineseJournalofInorganicAnalyticalChemistry,2015,5(2):9-11(in Chinese with English abstract).

[10] 仝曉紅,劉 攀,聶富強.堿熔-電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法測定高碳鉻鐵中鉻[J].冶金分析,2015,35(9):36-41.

TONG X H,LIU P,NIE F Q.Determination of chromium in high-carbon ferrochrome by alkali fusion-inductively coupled plasma atomic emission spectrometry[J].MetallurgicalAnalysis,2015,35(9):36-41(in Chinese with English abstract).

[11] SASAKI K,OGUMA S,NAMIKI Y,etal.Monoclonal antibody to trivalent chromium chelate complex and its application to measurement of the total chromium concentration[J].AnalyticalChemistry,2009,81(10):4005-4009.

[12] LIU X,XIANG J J,TANG Y,etal.Colloidal gold nanoparticle probe-based immunochromatographic assay for the rapid detection of chromium ions in water and serum samples[J].AnalyticaChimicaActa,2012,745(1):99-105.

[13] KUANG H,XING C R,HAO C L,etal.Rapid and highly sensitive detection of lead ions in drinking water based on a strip immunosensor[J].Sensors,2013,13(4):4214-4224.

[14] KIM N G,KIM M A,PARK Y I,etal.Magnetic nanoparticle based purification and enzyme-linked immunosorbent assay using monoclonal antibody against enrofloxacin[J].JournalofVeterinaryScience,2015,16(4):431-437.

[15] ZHANG X,WANG X,SUN M J,etal.A magnetic nanoparticle based enzyme-linked immunosorbent assay for sensitive quantification of zearalenone in cereal and feed samples[J].Toxins,2015,7(10):4216-4231.

[16] 王 津,生 威,王俊平,等.間接競爭酶聯(lián)免疫法檢測水樣中的重金屬鎘[J].食品與機械,2012,28(3):84-86.

WANG J,SHENG W,WANG J P.Development of heavy metal cadmium in water samples by indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay[J].Food﹠Machinery,2012,28(3):84-86(in Chinese with English abstract).

[17] VELANKI S,KELLY S,THUNDAT T,etal.Detection of Cd(II) using antibody-modified microcantilever sensors[J].Ultramicroscopy,2007,107(12):1123-1128.

[18] ZHU X X,HU B S,LOU Y,etal.Characterization of monoclonal antibodies for lead chelate complexes:applications in antibody-based assays[J].JournalofAgricultureandFoodChemistry,2007,55(13):4993-4998.

[19] DELEHANTY J B,JONES R M,BISHOP T C,etal.Identification of important residues in metal-chelate recognition by monoclonal antibodies[J].Biochemistry,2003,42(48):14173-14183.

[20] LIU F Q,LOU Y,SHI X Y,etal.Preparation and characterization of monoclonal antibody specific for copper chelate complex[J].JournalofImmunologicalMethods,2013,387(1):228-236.

[21] LEOPOLD K,FOULKES M,WORSFOLD P.Methods for the determination and speciation of mercury in natural waters A review[J].AnalyticaChimicaActa,2010(663):127-138.

[22] ALZARI P M,LASCOMBE M B,POLJAK R J.Three-dimensional structure of antibodies[J].AnnualReviewofImmunology,1988(6):555-580.

[23] LU L,LIU A,CHEN F,etal.X-ray absorption fine structure of artificial antigens for cadmium[J].SpectrochimicaActaPartA:MolecularandBiomolecularSpectroscopy,2011,82(1):345-350.

[24] LOVE R A,VILLAFRANCA J E,AUST R M,etal.How the anti-(metal chelate) antibody CHA255 is specific for the metal ion of its antigen:X-ray structures for two Fab′/hapten complexes with different metals in the chelate[J].Biochemistry,1993,32(41):10950-10959.

EstablishmentandPreliminaryApplicationofanIndirectCompetitiveELISAKitforDetectingTotalChromiumMassConcentrationinFood

WANG Yanan1,2,WANG Xiaofei3,ZHANG Yaling1,2,ZHANG Haitang1,2and WANG Ziliang1,2
(1.School of Animal Science and Technology,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang Henan 453003,China; 2.Key Discipline Open Laboratory of Henan Universites for Animal Viral Disease Control and Residual Analysis,Xinxiang Henan 453003,China; 3.School of Xinke,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang Henan 453003,China)

Aiming at development of an indirect competitive ELISA(icELISA) kit(Cr-Kit)for measuring total chromium mass concentration in food sample. The method of isothiocyanate(ITC) was used to conjugate Cr3+-iEDTA to bovine serum albumin(BSA) and immunogen Cr3+-iEDTA-BSA was obtained,which was identified by Ultraviolet(UV) and inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy(ICP-AES). BALB/c mice were immunized with Cr3+-iEDTA-BSA and hybridoma strains that secrete Cr3+-EDTA mAb were established by cell fusion,Cr3+-EDTA mAb were induced from in vivo method and their immunological properties were measured. Based on Cr3+-EDTA mAb,the Cr-Kit for measurement of total chromium mass concentration was developed and verified. The results showed that Cr3+-iEDTA-BSA was synthesized successfully and the quality of Cr3+and BSA in Cr3+-iEDTA-BSA were 140.8 mg/L and 5.81 g/L,respectively. Three hybridoma strains of 2A3C11,2A3D9,2A11G5 were picked out and the best one was 2A11G5 which secreted stable antibody after six passages and had affinity constant(Ka) for 2.69×109L/mol and had little or no cross-reactivity with other compounds. The Cr-Kit standard curve of the linear range was from 1.0 to 264 μg/L,limit of detection was 1.0 μg/L andIC50value was 8.37 μg/L. The average recovery rates of Cr3+-EDTA spiked in samples of river water ，rice,wheat flour and pork were 101.7%,96.47%,95.8% and 84.3%,respectively. The coincidence rate of the Cr-Kit was 100% with graphite furnace atomic absorption spectrometry(GFAAS) ,which was national standard determination method(GB5009.123-2014). In this study,Cr-Kit was successfully developed,it can meet the requirements of detection of total chromium mass residue in food.

Trivalent chromium ion; Immunogen; Monoclonal antibody; Indirect competitive ELISA kit; Total chromium mass concentration

2016-11-02

2016-12-29

Special Project of National Science & Technology Pillar Program during 12thFive-Year Plan(No.2011BAK10B01-15,No.2014BAD13B05-01).

WANG Yanan,female,master student.Research area:biotechnology of food safety.E-mail:792176339@qq.com

WANG Ziliang,male,Ph. D,professor.Research area:biotechnology of food safety. E-mail: wangziliang1966@163.com

潘學(xué)燕ResponsibleeditorPANXueyan)

日期：2017-12-21

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171221.1651.034.html

2016-11-02

2016-12-29

“十二五”國家科技支撐計劃(2011BAK10B01-15,2014BAD13B05-01)。

王亞楠,女,碩士研究生,從事食品安全生物技術(shù)研究。E-mail:792176339@qq.com

王自良,男,博士,教授,主要從事食品安全生物技術(shù)研究。E-mail:wangziliang1966@163.com

R392-33

A

1004-1389(2017)12-1868-09