FID-HPLC法測(cè)定木耳中維生素B2的含量

郭航宏，王雪丹，張念潔

維生素B2又叫核黃素（化學(xué)式：C17H20N4O6，式量376.37），微溶于水，在中性或酸性溶液中加熱亦可保持穩(wěn)定。為體內(nèi)黃酶類(lèi)輔基的組成部分（黃酶在生物氧化還原中發(fā)揮遞氫作用），當(dāng)維生素B2缺乏時(shí)，會(huì)影響機(jī)體的生物氧化，引發(fā)代謝障礙，故維生素B2是維持人體正常生理所必需的物質(zhì)。維生素B2通常不能在人體內(nèi)合成，且體內(nèi)維生素B2的儲(chǔ)存極為有限，故須每天通過(guò)飲食攝取。黑木耳是一種味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富的食用菌，含豐富的蛋白質(zhì)、維生素、膳食纖維及鐵、鈣等微量元素。而黑木耳中維生素B2含量更為蔬菜中其含量的10倍有余，被稱(chēng)為“素中之葷”[1]。目前維生素B2含量常用測(cè)定方法有HPLC-PDA、HPLC-UVD、毛細(xì)管電泳—激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)法（CE-LIF）、離子對(duì)高效液相色譜檢測(cè)法及高效液相熒光檢測(cè)器法（FID-HPLC）[2-5]等。本研究中筆者采用FID-HPLC測(cè)定木耳中的維生素B2的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 包括賽多利斯電子天平220S（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），超聲波清洗儀（型號(hào)KQ-100B，昆山市超聲儀器有限公司），高效液相色譜儀(日本日立公司，包括HITACHI Pump L-2130，HITACHI Autosampler L-2200，Organizer，HITACHI UV-VIS Detector L-2420）。

1.2 試藥 維生素B2標(biāo)準(zhǔn)品CAS：BW3601(中國(guó)計(jì)量科學(xué)院提供），木瓜蛋白酶CAS：9001-73-4（上海生物西寶有限公司提供）、高峰淀粉酶CAS號(hào)：9004-07-3（上海生物滬宇有限公司提供） ，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜分析條件[1，2]色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C8(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相：乙酸鈉溶液（0.05mol/L）:甲醇=65:35，熒光檢測(cè)的激發(fā)波長(zhǎng)462nm，發(fā)射波長(zhǎng)522nm，流速：1mL/min，進(jìn)樣量：20μL，柱溫：室溫。

2.2 對(duì)照品溶液制備[3，4]精密稱(chēng)維生素B2對(duì)照品0.0025mg，置于25mL棕色容量瓶中，先用部分流動(dòng)相溶解，超聲10min，冷卻至室溫，用流動(dòng)相定容，超聲。得0.2μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)[5]取1mL對(duì)照品溶液，用流動(dòng)相稀釋成5mL，超聲，得濃度為0.02μg/mL的溶液。在2.1中條件下測(cè)定，檢查儀器的精密度。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 儀器精密度實(shí)驗(yàn)Table1 Precision experiment

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制 分別精密移取對(duì)照品溶液1、2、3、4mL,分別置于5mL棕色容量瓶中以流動(dòng)相稀釋?zhuān)?，冷卻至室溫，定容。由面積和濃度進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程為 Y=7.421560×106X-2134.2（0-0.1μg ·mL-1）（R2=0.9999,n=3），在2.1中條件下測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 濃度與面積關(guān)系Table2 Relationship of concentration and peak area

2.5 樣品溶液的制備 精密稱(chēng)取樣品5g，置于100mL具塞錐形瓶中，加入0.1mol/L鹽酸溶液，高壓滅菌后，調(diào)pH至6.3左右，加入2mL混合酶溶液，搖勻后，過(guò)夜酶解。定容100mL容量瓶，先用部分流動(dòng)相溶解，超聲10min，冷卻至室溫，以流動(dòng)相定容，取上清液過(guò)濾膜作為待測(cè)液。

2.6 加樣回收率 取維生素B2標(biāo)準(zhǔn)品0.001g，入0.60，1.30，1.90mg，按照2.5項(xiàng)下的方法配制。在2.1中條件下測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （n=6）Table3 Results of recovery ratio

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取濃度為0.02mg/mL的對(duì)照品溶液，放置于室溫陰暗處1、2、4、8、12h，在2.1中條件下測(cè)定。結(jié)果表明樣品在12h內(nèi)穩(wěn)定。見(jiàn)表4。

2.8 樣品含量測(cè)定 取樣品，在2.1中條件下測(cè)定。按照回歸的方程計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)的峰面積As，用測(cè)定的峰面積Ai與標(biāo)準(zhǔn)峰面積As的比值，進(jìn)行木耳中維生素B2的含量計(jì)算。結(jié)果見(jiàn)表5。本實(shí)驗(yàn)維生素B2的HPLC色譜圖見(jiàn)圖1（A）（B）。

表4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Table4 Stability experiments

表5 維生素B2含量測(cè)定(n=6)Table5 The contents of vitamin b2 in samples

圖1 維生素B2的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)中需注意維生素B2損失的兩個(gè)主要因素：（1）可被光破壞：一定波長(zhǎng)的光波照射下發(fā)出熒光。在pH6～7的溶液中熒光最強(qiáng)，在其他條件恒定時(shí)，熒光強(qiáng)度F與維生素B2濃度C成正比；（2）在堿溶液中加熱可被破壞，此外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 維生素B2具有較強(qiáng)的熒光，溶液酸度對(duì)維生素B2的熒光光譜有較大影響。溶劑極性對(duì)維生素B2的熒光影響較大，極性越小熒光越強(qiáng)。金屬離子Fe3+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Al3+等使熒光有不同程度的猝滅,其中Fe3+的猝滅作用最為明顯[6]，故樣品前處理尤為重要。本研究所采用FID-HPLC法具有簡(jiǎn)便、快捷及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，為測(cè)定木耳中維生素B2提供了可靠依據(jù)，值得應(yīng)用推廣。

[1]楊文斌.木耳的營(yíng)養(yǎng)與生長(zhǎng)發(fā)育條件[J].吉林蔬菜,2016(6):38.

[2]王榮艷,賈麗,錢(qián)春燕.HPLC-PDA法同時(shí)測(cè)定功能性飲料中9種水溶性維生素[J].現(xiàn)代科學(xué)儀器,2010,(4):98-101.

[3]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].二部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社:2015232-1233.

[4]張暉,薛洪寶,馬濤,等.毛細(xì)管電泳—激光誘導(dǎo)熒光法檢測(cè)維生素B2的研究[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2017,39(1):92-95.

[5]陳光龍,李玉蘭,劉敏,等.高效液相色譜法測(cè)定復(fù)合維生素B片中4種組分的含量[J]中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志,2006,26(10):1256-1258.

[6]范婷婷.維生素的熒光光譜及分析方法研究[D]河北師范大學(xué),2010:9-28.