缺氧條件下GDF-15對(duì)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞成管的影響

尚小森，衛(wèi)兵艷，劉田福，陳小平*

(1.太原市中心醫(yī)院心內(nèi)科，山西 太原 030009；2.山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人類(lèi)疾病動(dòng)物模型山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030001）

缺氧條件下GDF-15對(duì)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞成管的影響

尚小森1，衛(wèi)兵艷2，劉田福2，陳小平1*

(1.太原市中心醫(yī)院心內(nèi)科，山西 太原 030009；2.山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人類(lèi)疾病動(dòng)物模型山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030001）

目的 通過(guò)缺氧發(fā)生裝置將心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞（CMECs）進(jìn)行缺氧，轉(zhuǎn)染GDF-15相關(guān)病毒，觀察其對(duì)CMECs成管的影響。方法 將CMECs分為五組：空白對(duì)照組、GDF-15siRNA轉(zhuǎn)染組、干擾對(duì)照組、過(guò)表達(dá)GDF-15組、過(guò)表達(dá)對(duì)照組，以上各組在缺氧發(fā)生裝置中進(jìn)行缺氧干預(yù)，Western blot測(cè)定各組細(xì)胞GDF-15蛋白的表達(dá)情況。通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)，觀察各組在缺氧條件下CMECs管腔結(jié)構(gòu)形成情況。結(jié)果 過(guò)表達(dá)組較其他組GDF-15蛋白表達(dá)明顯增加，干擾組明顯降低，缺氧條件較常氧，CDF-15表達(dá)增高。缺氧6h時(shí)CMECs過(guò)表達(dá)GDF-15組在Matrigel Matrix上形成管腔結(jié)構(gòu)，而GDF-15siRNA轉(zhuǎn)染組及對(duì)照組均未形成管腔結(jié)構(gòu)。結(jié)論 缺氧條件能促進(jìn)CMECs中 GDF-15的表達(dá)，GDF-15能夠促進(jìn)CMECs增殖及血管新生，為GDF-15在急性心肌梗死側(cè)支循環(huán)方面的研究奠定了基礎(chǔ)。

急性心肌梗死；側(cè)支循環(huán)；心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞；生長(zhǎng)分化因子-15

目前，人們?cè)诰窦吧矸矫娉袚?dān)著越來(lái)越大的壓力與責(zé)任，這與當(dāng)今社會(huì)逐漸加快的工作節(jié)奏密不可分，冠狀動(dòng)脈疾病也隨之逐漸增多，給國(guó)家?guī)?lái)巨大的社會(huì)負(fù)擔(dān)，并造成嚴(yán)重的醫(yī)療資源消耗及勞動(dòng)力損失。其中，急性心肌梗死則為頭號(hào)殺手，它是由于冠狀動(dòng)脈血管壁的痙攣或狹窄、閉塞所致，隨病情進(jìn)展，嚴(yán)重時(shí)可致心力衰竭[1]。急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction AMI），是在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊破裂的基礎(chǔ)上，產(chǎn)生冠脈急性血栓栓塞所致。對(duì)于冠心病，尤其是急性心肌梗死的有效預(yù)防和及時(shí)治療已成為目前心血管疾病領(lǐng)域的重要研究課題。有研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死（AMI）冠脈血流閉塞時(shí)，尤其是發(fā)病3～6 h內(nèi)的心?；颊?，其側(cè)支血管的形成對(duì)梗死面積的大小起至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，良好的側(cè)支循環(huán)可以維持AMI相關(guān)區(qū)域心肌的活性，可有效保護(hù)心功能，對(duì)患者的臨床預(yù)后及生活質(zhì)量有極大的改善[2]。新生血管是維持病理或正常組織血液供應(yīng)的重要機(jī)制之一，在急性心肌梗死時(shí)，對(duì)心肌細(xì)胞缺血、缺氧所產(chǎn)生的癥狀亦具有明顯改善作用，其中，側(cè)支循環(huán)的建立則尤為重要[3]。并且它是心肌以及其他臟器對(duì)于組織缺血產(chǎn)生的應(yīng)答和自我保護(hù)機(jī)制。

2006年發(fā)表在Circulation Research的兩項(xiàng)研究首先報(bào)道了生長(zhǎng)分化因子15（growth differentiation factor 15，GDF-15），TGF-β超家族成員之一，在缺血性心臟疾病中發(fā)揮著重要的保護(hù)機(jī)制[4]。研究發(fā)現(xiàn)，GDF-15參與了缺血/再灌注（Ischemia/Reperfusion）損傷后缺血心肌的修復(fù)。隨后，大量報(bào)道顯示：GDF-15是多種心源性疾病重要的診斷marker和預(yù)后指標(biāo)，故此，在缺血缺氧微環(huán)境中的GDF-15水平變化，以及GDF-15如何調(diào)控心肌細(xì)胞存活，血管新生以及改善心臟功能的基礎(chǔ)方面驗(yàn)證研究尚不明確。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于美國(guó)的Gibco公司；GDF-15 siRNA慢病毒、過(guò)表達(dá)GDF-15慢病毒購(gòu)于Elabscience生物科技有限公司；Anti-GDF15抗體（兔單克隆抗體）抗體購(gòu)于美國(guó)abcam公司；GDF-15引物及β-actin引物均于美國(guó)Gene Copoeia公司構(gòu)建。

1.2 細(xì)胞來(lái)源

心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞（CMECs）購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American type culture collection，ATCC）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

取CMECs復(fù)蘇后在37℃下、5%二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)融合后采用胰蛋白酶（0.25%）消化法，按1∶3分瓶傳代。

1.3.2 細(xì)胞進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染及分組

CMECs分5組：正常CMECs為空白對(duì)照組、GDF-15siRNA轉(zhuǎn)染組、干擾對(duì)照組、過(guò)表達(dá)GDF-15組、過(guò)表達(dá)對(duì)照組。轉(zhuǎn)染8 h后將各組細(xì)胞換液，每組各加2ml高糖完全培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待轉(zhuǎn)染72 h后用嘌呤霉素進(jìn)行抗性篩選。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞、傳代。再將以上5組分為細(xì)胞缺氧模型制備組及常氧組。

1.3.3 Western blot測(cè)定各組細(xì)胞在常氧及缺氧6h GDF-15蛋白表達(dá)情況

處理后的細(xì)胞用PBS緩沖液清洗干凈，用含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液在冰上裂解30 min，12000×g離心25 min（4℃），收集上清液。BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白高溫變性，加樣，5%的濃縮膠和15%的分離膠進(jìn)行跑膠，轉(zhuǎn)膜，用5%BSA封閉2 h，一抗4℃孵育過(guò)夜。TBST緩沖液洗3遍，每次5 min，二抗室溫孵育2h，TBST緩沖液洗3遍，每次5 min，洗凈，顯色，掃描。

1.3.4 CMECs體外成管實(shí)驗(yàn)

用預(yù)冷的槍頭將基質(zhì)膠在冰上以每孔50 μl鋪于96孔板中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置1 h，之后每孔加入100 μl的細(xì)胞懸液（2×104/孔）。按照5個(gè)分組處理細(xì)胞6 h后，觀察各組細(xì)胞管狀排列狀況及管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量、完整程度，并隨機(jī)選取5個(gè)視野，應(yīng)用Image J軟件分析顯微鏡下每個(gè)視野小管數(shù)量，結(jié)果以與正常組相比的百分?jǐn)?shù)表示。

2 結(jié) 果

2.1 各轉(zhuǎn)染組CMECs72 h后的生長(zhǎng)情況如下圖所示（圖1）

GDF-15過(guò)表達(dá)組細(xì)胞生長(zhǎng)明顯比其他組快，GDF-15siRNA組明顯比其他組慢。

2.2 對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行缺氧處理，如下圖所示（圖2）

觀察發(fā)現(xiàn)，缺氧12 h時(shí)90%以上細(xì)胞已壞死，因此取缺氧時(shí)間點(diǎn)為6 h。

2.3 常氧及缺氧6 h，各組GDF-15的表達(dá)情況

進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染后，觀察常氧及缺氧6 h時(shí)各組細(xì)胞GDF-15蛋白的表達(dá)情況：GDF-15過(guò)表達(dá)組實(shí)現(xiàn)了GDF-15過(guò)量表達(dá)，GDF-15siRNA轉(zhuǎn)染組實(shí)現(xiàn)了GDF-15的低表達(dá)，且缺氧后各組GDF-15蛋白表達(dá)量較常氧時(shí)均有所增加，缺氧刺激了GDF-15的表達(dá)。

2.4 缺氧6h時(shí)，CMECs成管實(shí)驗(yàn)結(jié)果

GDF-15過(guò)表達(dá)組的CMECs細(xì)胞在Matrigel Matrix上形成管腔結(jié)構(gòu)，而GDF-15siRNA組及對(duì)照組均未形成管腔結(jié)構(gòu)。如圖4。

圖1 病毒轉(zhuǎn)染72 h，各組CMECs生長(zhǎng)情況

圖2 缺氧發(fā)生裝置

圖3 常氧及缺氧6h，各組GDF-15的表達(dá)情況

圖4 缺氧6 h時(shí)，各組CMEcs成管實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

心肌梗死（Myocardial Infarction MI），是心肌缺血性壞死，是在冠狀動(dòng)脈病變的基礎(chǔ)上，發(fā)生冠狀動(dòng)脈血供急劇減少或中斷，使相應(yīng)的心肌嚴(yán)重而持久缺血導(dǎo)致心肌壞死。急性心肌梗死（AMI）可發(fā)生心律失常、休克或心力衰竭，屬急性冠脈綜合征的嚴(yán)重類(lèi)型。如何有效地預(yù)防及治療冠心病，特別是急性心肌梗死，已成為目前心血管疾病研究的重要領(lǐng)域。在我們前期的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，GDF-15具有促進(jìn)急性心肌梗死側(cè)枝循環(huán)形成的作用，本研究根據(jù)體內(nèi)急性心肌梗死時(shí)的組織缺氧環(huán)境構(gòu)建缺氧發(fā)生裝置，驗(yàn)證GDF-15能否促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及新生。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)：與缺氧6 h相比，當(dāng)缺氧2 h時(shí)，各組均未出現(xiàn)較明顯的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；缺氧12 h時(shí)，約90%的細(xì)胞發(fā)生壞死；因此選擇缺氧6 h的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀察與研究。

Western blot實(shí)驗(yàn)表明：病毒轉(zhuǎn)染后，GDF-15過(guò)表達(dá)組實(shí)現(xiàn)了GDF-15高表達(dá)，GDF-15siRNA組實(shí)現(xiàn)了GDF-15低表達(dá)。缺氧條件下各組GDF-15較常氧組表達(dá)量增多，說(shuō)明缺氧可能是GDF-15的一個(gè)刺激因素。

內(nèi)皮細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn)表明：觀察缺氧6 h時(shí)各組在Matrigel Matrix的成管情況，過(guò)表達(dá)GDF-15組較空白對(duì)照組細(xì)胞形成管腔樣結(jié)構(gòu)達(dá)90%以上，GDF-15siRNA轉(zhuǎn)染組未形成管腔樣結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)證明，GDF-15可明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞成管，可能為改善缺血心肌的局部血液循環(huán)，促進(jìn)血管新生以及側(cè)枝建立等起到關(guān)鍵作用。

綜上所述，GDF-15具有明顯促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，并形成管腔的作用，從而進(jìn)一步的闡明了GDF-15可以促進(jìn)急性心肌梗死側(cè)枝循環(huán)的形成，為缺血性心臟病及急性心肌梗死疾病的預(yù)防及治療運(yùn)用提供安全性必要保障。在下一步的研究中，我們將從細(xì)胞和動(dòng)物模型水平兩方面對(duì)GDF-15是如何促進(jìn)急性心肌梗死側(cè)枝循環(huán)的形成及其作用機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。

[1] 顧會(huì)平,吳明煜,郭曉紅.姜黃素對(duì)小鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其與Toll樣受體4／核因子 B信號(hào)通路的相關(guān)性[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2016,9(29):932-935.

[2] Andrew P, Patrick J,Bradford G,et al.Identification of a plasma metabolomic signature of thrombotic myocardial infarction that is distinct from non-thrombotic myocardial infarction and stable coronary artery disease[J].PLoS One,2017,12(4):91-98.

[3] Koushik R,Asma K,and Robert J H.Recent advances in the diagnosis and treatment of acute myocardial infarction [J].World J Cardiol,2015,7(5):243-276.

[4] 宋和鑒.生長(zhǎng)分化因子15(GDF-15)對(duì)缺氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、血管新生的影響及機(jī)制的研究[M].2014,5:2-4.

Explore the effects of GDF - 15 on the myocardial microvascular endothelial cells into a tube under hypoxia

SHANG Xiao-sen1,WEI Bing-yan2,LIU Tian-fu2,CHEN Xiao-ping1＊
(1.Department of Cardiology, Taiyuan Central Hospital,Shanxi Taiyuan 030009,China;2.Laboratory Animal Center, experimental animal and human disease animal model Shanxi Key Laboratory, Shanxi Medical University,Shanxi Taiyuan 030001,China.)

Objective Through hypoxia generator make myocardial microvascular endothelial cells hypoxia, transfect GDF-15 virus, Observe its effects on CMECs into tube.Methods CMECs can be divided into five groups: blank control group, GDF-15siRNA group, control group of interfere, overexpression of GDF - 15 groups, control group of overexpression. Put the above groups into hypoxia generator ;By using Western-blotting to evaluate the expression of GDF-15 under the hypoxia condition. By endothelial cells into tube experiments，observe CMECs lumen structure formation of each group.Results Overexpression group than other group GDF- 15 protein expression significantly increased, interference group significantly decreased, and the expression of GDF-15 under hypoxia is higher than oxygen condition. CMECs of overexpression group lumen structure formated in hypoxia 6h, opposite to GDF-15siRNA and other control groups.Conclusion Hypoxia conditions can promote the expression of GDF–15 of CMECs,GDF-15 can promote the proliferation and formation of collateral circulation of CMECs.It laid a foundation for the research of GDF-15 on collateral circulation in acute myocardial infarction.

Acute myocardial infarction;Coronary collateral circulation;CMECs;GDF-15

】R363

B

ISSN.2095-6681.2017.31.56.03

山西省國(guó)際科技合作項(xiàng)目（2014081050-1）；山西醫(yī)科大學(xué)青年研究基金（02201430）

陳小平

吳宏艷