三七多糖的安全性評價

王華晶+秦華炎+李懷宇

摘要：目的考察三七多糖（PNP）的毒理學(xué)安全性。方法進(jìn)行急性經(jīng)口毒性試驗；三項遺傳毒性試驗（Ames試驗、骨髓微核試驗、小鼠精子畸形試驗）；30天喂養(yǎng)試驗。結(jié)果以最大給藥量（劑量為30000 mg·kg-1 W）的樣品給予小鼠灌胃后，未見動物有中毒癥狀，無動物死亡，試驗結(jié)束解剖動物，大體觀察未見異常，急性經(jīng)口毒性屬無毒級；三項遺傳毒性試驗結(jié)果均為陰性；以2670、2000、1335 mg·kg-1 W（分別相當(dāng)于人體推薦用量100、75、50倍）3個劑量的樣品連續(xù)給大鼠灌胃30 d，實驗期間動物的生長發(fā)育良好，各劑量組的動物體重、增重量、進(jìn)食量、食物利用率、血常規(guī)指標(biāo)、血生化指標(biāo)、臟器重量及臟器/體重比值與對照組比較，均無顯著性差異（P>0.05）；大體解剖觀察和組織病理學(xué)檢查未見與樣品有關(guān)的異常改變。在受試劑量范圍內(nèi)未見該樣品對大鼠各項觀察指標(biāo)產(chǎn)生毒副作用。結(jié)論三七多糖具有良好的安全性。

關(guān)鍵詞：三七多糖；安全性；急性毒性；遺傳毒性；30天喂養(yǎng)試驗

中圖分類號：R965.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1007-2349（2017）12-0056-05

【Abstract】Objective： To study the toxicological safety of Panax Notoginseng polysaccharide （PNP）. Methods： Acute oral toxicity test， three genotoxicity tests （Ames test， bone marrow micronucleus test and mouse sperm abnormality test） and 30 days feeding test were conducted. Results： After the mice were given gavage with the maximal dose （30000 mg·kg-1 W）， no animals were poisoned and no animals were killed. At the end of the experiments， the animals were dissected and no abnormalities were observed. The acute oral toxicity was non-toxic. The three genotoxicity test results were negative. The rats were given gavage with 2670， 2000 and 1335 mg·kg-1 W （respectively equivalent to the weight of human body recommended dose 100， 75 and 50 times） for 30 days. The growth and development of the animals during the experiments were good. Compared with those of the control group， the weight， weight gain， food intake， food utilization， blood index， blood biochemical index， organ weight and organ/body weight ratio of each group with different doses had no significant difference （P>0.05）. There were no abnormal changes related to the samples in the gross anatomy and histopathological examination. In the dose range of the samples，the side effects of various indicators of rat toxicity were not seen. Conclusion： Panax notoginseng polysaccharide has good safety.

【Key words】Panax notoginseng polysaccharide， safety， acute toxicity， genotoxicity， 30-day feeding test

三七[Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen]為五加科人參屬多年生草本植物，又名參三七、田七等名。三七自古以來是傳統(tǒng)的名貴中藥材，主產(chǎn)地云南文山。三七的化學(xué)研究始于二十世紀(jì)三十年代，而隨著配糖體成分分離和結(jié)構(gòu)鑒定技術(shù)的發(fā)展，自八十年代以來才有顯著進(jìn)展[1]。三七中的化學(xué)成分，包括皂苷（saponins），多糖（polysaccharides），黃酮（flavonoids），聚炔醇（polyalkynols），氨基酸（amino acids）和脂肪酸（fatty acids），以及環(huán)肽類（cyclopeptides）等，但目前對三七的研究主要集中在皂苷類化合物，對其他有效成分的研究不足。多糖幾乎存在于所有的動物、植物及微生物體內(nèi)，參與機(jī)體生理代謝，具有降血糖、降血脂、預(yù)防和治療糖尿病、抗腫瘤、抗氧化等生理功能[2-6]，因此備受關(guān)注。本課題組多年來從事三七資源的開發(fā)利用，從提取過三七皂苷的三七廢渣中，提出了含量為56.70%，得率為1.71%（三七干燥藥材的百分比）的三七多糖[7]；發(fā)現(xiàn)三七多糖可提高小鼠的細(xì)胞免疫與體液免疫[8]；能延長荷肝癌H22小鼠生存期[9]。為了進(jìn)一步開發(fā)利用三七多糖，本文研究其毒理學(xué)安全性，以期為三七多糖的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1材料

1.1試藥、試劑三七多糖 取適量提取三七皂苷后的三七廢渣，第一次加入10倍量水，沸水浴煮8h，收集濾液，第二次加入5倍量水，沸水浴8h。合并兩次濾液，4500 rpm離心5 min，取上清。80℃旋轉(zhuǎn)濃縮至原體積的1/8，靜置24 h，離心，棄沉淀，緩慢加入三倍無水乙醇，邊加邊攪拌，4℃放置12h，抽濾得沉淀。75%乙醇洗滌沉淀數(shù)次，將乙醇揮發(fā)干后用適量水溶解，離心，收集上清，加入三倍無水乙醇，4℃放置12h，抽濾得沉淀，75%乙醇洗滌沉淀，50℃烘箱烘干，即得三七多糖試藥。

環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）、小牛血清（Gibco公司）、TA97a、TA98、TA100、TA102標(biāo)準(zhǔn)菌株、S9、2-氨基芴、柔毛霉素、敵克松、疊氮鈉、1，8-二羥基蒽醌、吉姆薩（Giemsa）染色試劑盒（上海哥凡生物科技有限公司）、伊紅染色液、甲醇等。

1.2動物、儀器SPF級健康昆明種小鼠[由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（桂）2009-0002，實驗動物質(zhì)量合格證號：0001270，SPF級健康SD種大鼠]由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2008-0002，質(zhì)量合格證號：0081568，SPF級實驗動物使用許可證號：SYXK（桂）2007-0003。實驗動物室溫度：22～25 ℃，相對濕度：55～70%。

實驗室常用解剖器械、電子天平、培養(yǎng)皿、恒溫培養(yǎng)箱、載玻片、光學(xué)顯微鏡、血液分析儀、全自動生化分析儀（德國Roche 規(guī)格型號Cobas c311）。

2方法

2.1小鼠急性經(jīng)口毒性試驗采用最大給藥量試驗法，選體重18～22 g的昆明種小鼠20只，雌雄各半。試驗前動物禁食16 h，不限飲水。稱取50.0 g樣品，加純水至100 mL，混勻、配成500 mg·mL-1濃度溶液，然后給動物灌胃3次（每次間隔4h），每次灌胃量為0.02 mL·g-1 BW，合計劑量為30000 mg·kg-1 BW。灌胃后觀察、記錄動物的中毒表現(xiàn)。每周稱重一次，觀察兩周時間，試驗結(jié)束解剖動物進(jìn)行大體觀察。按毒性分級標(biāo)準(zhǔn)評價受試物的急性毒性。

2.2Ames 試驗采用經(jīng)鑒定符合要求的鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102四種菌株進(jìn)行試驗。稱取5.0 g樣品，加純水溶解至100 mL，配成50 mg·mL-1濃度溶液，再依次5倍稀釋（取10 mL 加純水至50 mL），分別配成10、2、0.4、0.08 mg·mL-1 濃度溶液，共5個濃度受試溶液，經(jīng)高壓滅菌（0.103 Mpa 20 min）處理后供試驗用。以多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)的大鼠肝微粒體酶（S-9）作為體外代謝活化系統(tǒng)。采用平板摻入法，在保溫的頂層培養(yǎng)基中依次加入0.1 mL試驗菌株增菌液、0.1 mL受試物溶液和0.5 mL S-9混合液（當(dāng)需要代謝活化時），混勻后倒入底層培養(yǎng)基平板上。5個試驗劑量分別為5000、1000、200、40、8 μg/皿，同時設(shè)自發(fā)回變對照、溶劑對照和陽性突變劑對照。自發(fā)回變對照除不加樣品外，其余條件與樣品組相同。溶劑對照用滅菌純水替代樣品，其余條件與樣品組相同。每個劑量組的各種菌株均做3個平行皿。在37 ℃下培養(yǎng)48 h，計數(shù)每皿的菌落數(shù)。整套試驗在相同條件下重復(fù)做兩次。如果受試物的回變菌落數(shù)增加超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍以上，并具有劑量-反應(yīng)關(guān)系者，即為誘變試驗陽性。

2.3小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗采用間隔24小時兩次經(jīng)口灌胃法進(jìn)行試驗。選體重為25～30 g 的昆明種小鼠50只，隨機(jī)分成5組，每組10只，雌雄各半。試驗組3個劑量分別設(shè)10000、5000、2500 mg·kg-1 BW以純水為陰性對照，40 mg·kg-1 BW劑量的環(huán)磷酰胺（cp）作陽性對照。分別稱取20.0、10.0、5.0 g樣品，各加純水至40 mL，混勻、配成500、250、125 mg·mL-1濃度溶液，然后按0.02 mL·g-1 BW的體積給動物灌胃，陰性對照組灌給等體積的純水，陽性對照組灌給等體積的2 mg·mL-1環(huán)磷酰胺溶液。第二次給樣后6小時頸椎脫臼處死動物，取胸骨骨髓用小牛血清稀釋涂片，甲醇固定，Giemsa染色。在光學(xué)顯微鏡下，每只動物計數(shù)1000個嗜多染紅細(xì)胞（PCE），微核率以含微核的PCE千分率計，同時計數(shù)200個嗜多染紅細(xì)胞，計算嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞的比值（PCE/NCE）。采用泊松分布均數(shù)比較法統(tǒng)計處理。如試驗組的微核率比陰性對照組增高，并有明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系和統(tǒng)計學(xué)意義，即為陽性結(jié)果。

2.4小鼠精子畸形試驗選體重為25～35 g的昆明種雄性小鼠50只，隨機(jī)分成5組，每組10只。試驗組3個劑量分別設(shè)10000、5000、2500 mg·kg-1 BW，以純水為陰性對照，40 mg·kg-1 BW劑量的環(huán)磷酰胺（cp）作陽性對照。分別稱取20.0、10.0、5.0 g樣品，各加純水至40 mL，混勻、配成500、250、125 mg·mL-1濃度溶液，然后按0.02 mL·g-1 BW的體積給動物灌胃，陰性對照灌給等體積的純水，陽性對照組灌給等體積的2 mg·mL-1環(huán)磷酰胺溶液。每天灌胃一次，連續(xù)5天。末次給樣后第30天處死動物，取副睪的精子涂片，甲醇固定，伊紅染色。在光學(xué)顯微鏡下，每只動物計數(shù)完整精子1000個，計算精子畸形率，采用χ2檢驗統(tǒng)計處理。如試驗組的精子畸形率比陰性對照組增高，并有明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系和統(tǒng)計學(xué)意義，即為陽性結(jié)果。

2.5大鼠30天喂養(yǎng)試驗

2.5.1劑量選擇與受試物給予方式選SD種大鼠80只，雌雄各半，雄鼠體重（70.2±4.7）g，雌鼠體重（65.0±3.8）g。將動物隨機(jī)分為4組，即陰性對照組和3個試驗組，每組20只，雌雄各半。3個試驗組劑量分別設(shè)為2670、2000、1335 mg·kg-1 BW，分別相當(dāng)于人體推薦劑量的100、75、50倍。分別稱取26.70、20.00、13.35 g樣品，各加純水至100 mL，混勻、配成267.0、200.0、133.5mg·mL-1濃度溶液，按10.0 mL·kg-1 BW的體積給相應(yīng)劑量組動物灌胃，陰性對照組灌給等體積的純水，每天灌胃一次，連續(xù)灌胃30 d。

2.5.2實驗方法實驗期間所有動物給予普通飼料，單籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水。每天觀察動物的活動和生長情況，每周加食2次，記錄給食量和剩食量，每周稱一次體重，計算每周進(jìn)食量和食物利用率。實驗結(jié)束動物禁食過夜，次日早上稱動物空腹體重，然后處死大鼠，采2份血樣，一份血抗凝用血球計數(shù)儀檢測Hb、RBC、WBC及其分類、PLT等；另一份血不抗凝分離血清，用試劑盒和全自動生化分析儀檢測血清AST、ALT、BUN、Cr、TC、Tg，Glu、TP、Alb等項目。采血后解剖動物，

進(jìn)行大體觀察，取肝臟、腎臟、脾臟和睪丸等臟器進(jìn)行稱重，計算臟/體比值，取肝臟、腎臟、脾臟、胃、十二指腸、睪丸和卵巢等臟器進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。在對各劑量組動物作大體檢查未發(fā)現(xiàn)明顯病變和生化指標(biāo)改變時，只進(jìn)行高劑量組和對照組動物的主要臟器的組織病理學(xué)檢查，如發(fā)現(xiàn)病變則對中、低劑量組相應(yīng)器官及組織進(jìn)行檢查。

2.5.3實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計應(yīng)用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析。在統(tǒng)計分析時，先對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗，若方差齊，采用單因素方差分析進(jìn)行總體比較，發(fā)現(xiàn)差異再用Dunnett檢驗進(jìn)行多個劑量組與對照組均數(shù)間的兩兩比較。若方差不齊則對數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，滿足方差齊性檢驗后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計；若轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)仍未達(dá)到方差齊要求，改用秩和檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。

3結(jié)果

3.1急性經(jīng)口毒性試驗采用最大給藥量的樣品給小鼠灌胃后，觀察小鼠14天，雄性小鼠初始、第7天、第14天平均體重分別為（20.0±0.4）g，（26.3±1.0）g，（32.2±1.3）g，雌性小鼠初始、第7天、第14天平均體重分別為（20.2±0.6）g，（26.0±0.9）g，（30.9±1.3）g，小鼠生長良好，體重未受影響。無中毒癥狀，未發(fā)現(xiàn)死亡小鼠。試驗結(jié)束解剖動物、大體觀察，肝、腎等主要臟器均未見明顯異常改變，根據(jù)急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，三七多糖的急性經(jīng)口毒性屬無毒級。

3.2Ames試驗從表1、表2可見，受試物的回變菌落數(shù)均未超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，也無劑量-反應(yīng)關(guān)系，該受試物誘變試驗結(jié)果為陰性。

3.3小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗試驗組3個劑量分別是10000、5000、2500 mg·kg-1 BW。雄性小鼠組，微核發(fā)生率（‰）分別為（0.6±0.5）、（1.2±0.8）、（1.0±0.0），與陰性對照組（1.2±0.4）無顯著性差異（P>0.05），陽性對照組（26.2±2.8）與陰性對照組有顯著性差異（P<0.01）。雌性小鼠組，微核發(fā)生率（‰）分別為（1.0±0.7）、（1.2±0.4）、（0.8±0.8），與陰性對照組（1.4±0.9）無顯著性差異（P>0.05），陽性對照組（24.4±4.0）與陰性對照組有顯著性差異（P<0.01）。表明三七多糖對小鼠的骨髓細(xì)胞無損傷作用。

3.4小鼠精子畸形試驗試驗組3個劑量分別設(shè)10000、5000、2500 mg·kg-1 BW，小鼠精子畸形發(fā)生率（%）分別為（1.37±0.37）、（1.43±0.29）、（1.39±0.19）與陰性對照組（1.45±0.23）無顯著性差異（P>0.05），陽性對照組（4.32±0.48）與陰性對照組有顯著性差異（P<0.01）。表明三七多糖對小鼠精子無畸變作用。

3.5大鼠30 d喂養(yǎng)試驗

3.5.1動物一般表現(xiàn)實驗期間，觀察各組大鼠，生長發(fā)育良好，未見有異常行為、中毒表現(xiàn)、死亡現(xiàn)象。

3.5.2三七多糖對大鼠體重及食物利用率的影響結(jié)果見表3，以2670、2000、1335 mg·kg-1 BW劑量的三七多糖給大鼠灌胃30天，實驗期間，三七多糖各劑量組大鼠的體重、增重量、進(jìn)食量、食物利用率等指標(biāo)與對照組無顯著性差異（P>0.05），表明三七多糖對大鼠的體重及食物利用率無明顯影響。

3.5.4三七多糖對大鼠血液生化指標(biāo)的影響結(jié)果見表5，以 2670、2000、1335 mg·kg-1 BW 劑量的三七多糖給大鼠灌胃30天，各劑量組大鼠的AST、ALT、BUN、Cr、TC、Tg，Glu、TP、Alb對照組無顯著性差異（P>0.05），表明三七多糖對大鼠的血液生化指標(biāo)無明顯影響。

3.5.5三七多糖對大鼠臟器重量及臟器/體重比值的影響以2670、2000、1335 mg·kg-1 BW 劑量的三七多糖給大鼠灌胃30天，采血后解剖動物，進(jìn)行大體觀察，取肝臟、腎臟、脾臟和睪丸等臟器進(jìn)行稱重，計算臟/體比值，各劑量組大鼠的臟器重量及臟器/體重比值與對照組無顯著性差異（P>0.05），表明三七多糖對大鼠的臟器重量及臟器/體重比值無明顯影響。

3.5.6解剖大體觀察及組織學(xué)檢查結(jié)果實驗結(jié)束解剖動物，大體觀察各組動物均未發(fā)現(xiàn)明顯病變。故只選三七多糖的高劑量組和陰性對照組動物的主要臟器進(jìn)行組織病理切片檢查。結(jié)果顯示，高劑量組有1只雌性、對照組有1只雄性和1只雌性大鼠的肝臟組織可見肝細(xì)胞點狀壞死，高劑量組有1只雄性、對照組有1只雄性和1只雌性大鼠的肝臟匯管區(qū)可見少量炎細(xì)胞浸潤；兩組均有1只雄性和1只雌性大鼠的腎臟皮質(zhì)部間質(zhì)可見少量炎細(xì)胞浸潤。以上組織病變屬動物的自發(fā)輕型病變，且兩組動物的組織病變程度相似，故可以排除是三七多糖所致，其他臟器組織未見病理組織學(xué)改變，表明三七多糖對大鼠的上述臟器組織無損害作用。

4結(jié)論

以最大給藥量（劑量為30000 mg·kg-1 BW）的三七多糖給予小鼠灌胃后，未見動物有中毒癥狀和死亡，急性經(jīng)口毒性屬無毒級。

三項遺傳毒性試驗（Ames試驗、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗）結(jié)果均為陰性。30天喂養(yǎng)試驗，以2670、2000、1335 mg·kg-1 BW 3個劑量（分別相當(dāng)于人體推薦用量100、75、50倍）的三七多糖連續(xù)給大鼠灌胃30天，實驗期間動物生長發(fā)育良好，各劑量組大鼠的體重、增重量、進(jìn)食量、食物利用率、血常規(guī)指標(biāo)、血液生化指標(biāo)、臟器重量及臟器/體重比值等均未受明顯影響；大體解剖觀察和組織病理學(xué)檢查未見與三七多糖有關(guān)的異常改變。在受試劑量范圍內(nèi)未見三七多糖對大鼠各項觀察指標(biāo)產(chǎn)生毒副作用。

致謝：感謝廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心毒理室對本項目的支持。參考文獻(xiàn)：

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（收稿日期：2017-10-24）