淺談對(duì)微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法的相關(guān)思考

劉慶慶 劉巍

摘 要： 筆者針對(duì)中國(guó)藥典2015 年版非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法的主要增修訂情況進(jìn)行了相關(guān)解讀。

關(guān)鍵詞： 微生物限度檢查；計(jì)數(shù)法

0 引言

2014 年3月28日，國(guó)家藥典委員會(huì)發(fā)布了《中國(guó)藥典》2015年版通則征求意見(jiàn)稿（通則公示稿），與《中國(guó)藥典》2010 年版比較，2015年版在微生物限度檢查方法和指導(dǎo)原則上均做了較大的修訂。修訂的內(nèi)容主要包括了非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法（ 通則1105）、非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法（通則1106）及非無(wú)菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（通則1107）等，修訂后的微生物限度檢查方法與《美國(guó)藥典》基本一致。這對(duì)于需要進(jìn)口或出口的藥品生產(chǎn)企業(yè)來(lái)說(shuō)，因檢測(cè)方法基本一致，檢測(cè)結(jié)果將具有可比性，并減少了資源浪費(fèi)。

1 藥品微生物限度檢查法的變遷

1995 年版《中國(guó)藥典》第一次提出藥品微生物限度檢查法，2005 年版《中國(guó)藥典》第一次提出要對(duì)所有用于檢查藥品微生物的方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，以防因檢驗(yàn)方法不科學(xué)造成漏檢或誤判；2010 年版《中國(guó)藥典》中則又一次強(qiáng)調(diào)了進(jìn)行微生物檢驗(yàn)方法學(xué)驗(yàn)證的重要性，強(qiáng)調(diào)方法確認(rèn)過(guò)程；2015年版《中國(guó)藥典》將方法學(xué)驗(yàn)證修訂為方法適用性試驗(yàn)，更加重視對(duì)于檢驗(yàn)全過(guò)程的控制，達(dá)到試驗(yàn)條件、檢驗(yàn)方法和判定標(biāo)準(zhǔn)三者的統(tǒng)一，使檢驗(yàn)結(jié)果更具可比性，真正做到與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)接軌。

2 藥品微生物計(jì)數(shù)方法的建立和確認(rèn)

2.1 檢驗(yàn)方法的選擇

藥品微生物計(jì)數(shù)方法通常包括平皿法、薄膜過(guò)濾法和最可能數(shù)法（簡(jiǎn)稱MPN 法）。平皿法應(yīng)用較廣，是最常用的微生物計(jì)數(shù)方法，也是方法適用性試驗(yàn)的首選；薄膜過(guò)濾法適用于有較強(qiáng)抑菌作用且具較強(qiáng)溶液性的供試品；最可能數(shù)法因其精確度較差，更適合于某些受微生物污染程度較小的供試品。在選擇計(jì)數(shù)方法時(shí)，首先應(yīng)根據(jù)供試品的理化特性和微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，選擇操作簡(jiǎn)便、快速的方法；其次應(yīng)考慮供試品的抑菌性，在使用中和劑或消除抑菌作用時(shí)應(yīng)避免損傷供試品中污染的微生物。選擇方法后應(yīng)對(duì)所選方法的適用性進(jìn)行確認(rèn)。

2.2 檢驗(yàn)方法的建立

一般來(lái)說(shuō)，多數(shù)中成藥制劑都需要進(jìn)行需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)，通常應(yīng)依據(jù)藥品自身的特點(diǎn)和標(biāo)準(zhǔn)限值，來(lái)擬定檢驗(yàn)方法，并對(duì)計(jì)數(shù)方法進(jìn)行適用性試驗(yàn)，并確認(rèn)其結(jié)果的有效性。例如，實(shí)驗(yàn)室采用不同的方法測(cè)定某中成藥口服液的需氧菌總數(shù)，由于中藥制劑受微生物污染的可能性較大，故先擬定平皿法和薄膜過(guò)濾法為檢驗(yàn)方法，并對(duì)此方法進(jìn)行適用性試驗(yàn)。

2.2.1 供試液的制備

取供試品10g，加入pH7.0 的無(wú)菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液至100 mL，充分振搖使其溶解，制成1∶10 比例的均勻供試液備用。

2.2.2 菌液制備

接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌以及枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物到胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，在35℃的溫度下培養(yǎng)18～24 h，并將此培養(yǎng)物用0.9% 無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至菌落數(shù)約為104 cfu/mL 的菌懸液。

2.2.3 試驗(yàn)方法

（1）平皿法試驗(yàn)組：取上述供試液9.9 mL，加入上述菌懸液0.1 mL，使之充分混合均勻，吸取1 mL 混合液至無(wú)菌平皿中，然后傾注胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，混合均勻，凝固，需平行制備2個(gè)平皿，在35℃溫度下培養(yǎng)3 d。

（2）薄膜過(guò)濾法試驗(yàn)組：試驗(yàn)前應(yīng)先將少量的pH7.0的無(wú)菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液濾過(guò)，以潤(rùn)濕濾膜，然后取上述供試液1mL，加入100 mL上述稀釋液，充分混勻，全量濾過(guò)后以此稀釋液沖洗濾膜，每次沖洗100mL，沖洗3次，總沖洗量為300mL，在第3次沖洗液中加入不高于100cfu的試驗(yàn)菌液，混合均勻后抽濾，然后轉(zhuǎn)移濾膜，使其菌面朝上貼在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，在35℃的條件下培養(yǎng)3d。

供試品對(duì)照組：取以上供試液，用稀釋液代替菌液同試驗(yàn)組進(jìn)行操作。菌液對(duì)照組：用稀釋液代替供試液，按試驗(yàn)組方法加入試驗(yàn)菌液。

3 計(jì)數(shù)法適用范圍的變化

3.1 嗜溫細(xì)菌和真菌的計(jì)數(shù)

修訂后的微生物計(jì)數(shù)法系用于能在有氧條件下生長(zhǎng)的嗜溫細(xì)菌和真菌的計(jì)數(shù)。與醫(yī)藥相關(guān)的細(xì)菌大多數(shù)是嗜溫的，其生長(zhǎng)溫度為20～40℃，真菌是一類重要的致病源，人類最常見(jiàn)的真菌病原體可以分為酵母、霉菌和皮膚真菌。盡管嗜溫細(xì)菌、真菌是影響藥物安全性最主要的因素，其他與特定藥品相關(guān)微生物也需要關(guān)注其有害性。新版藥典以微生物的生理特點(diǎn)和生長(zhǎng)特性為依據(jù)，科學(xué)地將細(xì)菌數(shù)修訂為需氧菌總數(shù)（定義為生長(zhǎng)在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上所有菌落，也包括霉菌和酵母菌），霉菌和酵母菌數(shù)修訂為霉菌和酵母菌總數(shù)（一般指生長(zhǎng)在沙氏葡萄糖瓊脂上的所有菌落，也包括細(xì)菌菌落數(shù)）。如果由于細(xì)菌的生長(zhǎng)而使霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)結(jié)果不符合微生物限度要求，可使用含有抗生素的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基重新進(jìn)行計(jì)數(shù)。

3.2 新版藥典計(jì)數(shù)法不適用于活菌制劑的檢查

微生態(tài)活菌制品是由非致病的活菌組成，本身即是微生物，因此新版藥典第三部各論項(xiàng)下的微生態(tài)活菌制品總論對(duì)其檢測(cè)有專門(mén)規(guī)定。修訂后的非無(wú)菌產(chǎn)品微生物計(jì)數(shù)法明確了其不適用于活菌制劑的檢查，增加了中國(guó)藥典2010年版一、二部未規(guī)定的事項(xiàng)，方法的應(yīng)用范圍更加明晰、嚴(yán)謹(jǐn)。

3.3 明確了可采用替代法

可采用自動(dòng)檢測(cè)等方法替代藥典方法，但須證明替代方法等效于藥典規(guī)定的方法。這一原則使得方法更具科學(xué)性、時(shí)代性、開(kāi)放性和靈活性，有利于鼓勵(lì)方法創(chuàng)新和現(xiàn)代儀器設(shè)備的使用，促進(jìn)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展。

3.4 增加了檢測(cè)產(chǎn)品范圍

新版藥典規(guī)定微生物計(jì)數(shù)法適用于生物制品和醫(yī)療器械等其他產(chǎn)品，強(qiáng)調(diào)了除藥品外的其他醫(yī)藥產(chǎn)品也可應(yīng)用。

4 計(jì)數(shù)法檢測(cè)環(huán)境的變化

中國(guó)藥典2010年版規(guī)定微生物限度檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級(jí)下的局部潔凈度100 級(jí)單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。而2010 年版《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》，引入了動(dòng)態(tài)連續(xù)監(jiān)測(cè)，將藥品生產(chǎn)所需的潔凈區(qū)分為A、B、C、D 4 個(gè)級(jí)別。各國(guó)藥典對(duì)檢驗(yàn)檢測(cè)環(huán)境通常只做出了在適宜的潔凈度的環(huán)境中進(jìn)行的要求?；谖覈?guó)國(guó)情，新版藥典對(duì)檢驗(yàn)檢測(cè)環(huán)境僅做原則性要求，試驗(yàn)環(huán)境必須符合微生物限度檢查的要求。但在通則9203 藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則中給出具體指導(dǎo)意見(jiàn)，微生物計(jì)數(shù)試驗(yàn)應(yīng)在受控潔凈環(huán)境下的局部潔凈度不低于B 級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。對(duì)出具法定藥品檢驗(yàn)報(bào)告書(shū)的實(shí)驗(yàn)室，檢驗(yàn)環(huán)境低于生產(chǎn)環(huán)境將會(huì)導(dǎo)致報(bào)告書(shū)的權(quán)威性受到挑戰(zhàn)，從長(zhǎng)遠(yuǎn)的觀點(diǎn)看，檢驗(yàn)環(huán)境應(yīng)不低于生產(chǎn)環(huán)境。

5 計(jì)數(shù)檢測(cè)用試劑試藥的變化

污染微生物在供試品中的分布具有隨機(jī)性、不均勻性的特點(diǎn)，供試液制備過(guò)程中，中和劑、滅活劑和表面活性劑應(yīng)對(duì)微生物生長(zhǎng)無(wú)毒，相互間具有相容性，有利于供試品中微生物均勻分布，提高計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性以真實(shí)反映藥物的微生物污染狀況。中國(guó)藥典2015年版新增了“供試液制備時(shí)如果使用了表面活性劑，應(yīng)確認(rèn)其對(duì)微生物無(wú)毒性及所使用中和劑或滅活劑的相容性”的要求。相容性要求供試品不一定要完全溶解于稀釋液中，但要均勻分散，形成均一、穩(wěn)定的供試液分散體系，這是獲得高準(zhǔn)確性和良好檢驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)。

結(jié)語(yǔ)

新版藥典微生物檢查體系在樣品前處理、微生物選擇性培養(yǎng)和鑒定確認(rèn)等方面的規(guī)定更為靈活，為檢驗(yàn)技術(shù)的創(chuàng)新發(fā)展提供了空間，有利于藥品質(zhì)量從最終產(chǎn)品檢驗(yàn)向過(guò)程控制轉(zhuǎn)變。通過(guò)增修訂，新版藥典藥品微生物控制標(biāo)準(zhǔn)體系不僅實(shí)現(xiàn)了中國(guó)藥典三部通則的統(tǒng)一，且解決了中國(guó)藥典與ICH 協(xié)調(diào)案的協(xié)調(diào)問(wèn)題，完全實(shí)現(xiàn)了與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的接軌，必將為推動(dòng)我國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)及藥品的國(guó)際交流與貿(mào)易做出積極貢獻(xiàn)。

參考文獻(xiàn)

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典：2015 年版四部. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.

[2] 胡昌勤. 藥品微生物控制現(xiàn)狀與展望. 中國(guó)藥學(xué)雜志，2015，50（20）：1747-1751.