一種急性肝損傷再生修復(fù)模型的建立

王朝陽，朱美意，張宏偉，歐陽軍

隨著對肝臟疾病研究的不斷深入，肝臟模型的要求也在不斷提高和發(fā)展，建立一種理想且簡單的急性肝損傷修復(fù)模型，對研究肝損傷、肝修復(fù)、肝移植等具有重要意義。目前，常見的急性肝損傷模型主要有病毒性模型、免疫性模型及化學(xué)性模型[1-3]，以及Higgins和Aderson[4]建立的70%肝切除模型，此切除模型應(yīng)用廣泛，但仍存在出血多，操作復(fù)雜等缺點。理想的肝損傷修復(fù)動物模型應(yīng)至少具備以下特點：（1）符合倫理要求，避免倫理因素的制約；（2）取材方便、經(jīng)濟實惠、可利用度高且易在各類實驗室推廣；（3）操作簡單、技術(shù)成熟、易于被各類科研工作者所掌握；（4）模型穩(wěn)定、可重復(fù)性高、制作周期短、實用性強、成功率高；（5）模型能準確再現(xiàn)肝損傷后、肝再生修復(fù)的演進及其發(fā)展，不改變其原始狀況，且能為各類干預(yù)措施搭建穩(wěn)定的平臺并進行客觀公正的評估；（6）損傷后再生修復(fù)的肝組織是研究肝再生修復(fù)的“金標準”材料；（7）對人體安全無危害、環(huán)境污染小。目前，尚無一種肝損傷模型能夠滿足上述全部要求，本實驗嘗試性進行了肝左外葉70%切除術(shù)造模，獲得了一種理想的肝急性損傷模型，經(jīng)文獻復(fù)習(xí)，目前鮮有單純肝葉部分切除造模的報告及應(yīng)用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 5周齡、清潔級斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬祝⊿prague-Dawley，SD）大鼠30只，體重（180±10）g，雌雄不限，由新疆醫(yī)科大學(xué)動物飼養(yǎng)中心[許可證號XJZZQ（XK）200301]提供，由石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院動物飼養(yǎng)中心分籠飼養(yǎng)，保持12 h光照、12 h避光循環(huán)，恒溫恒濕、標準飼料、自由飲水。經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照隨機抽樣原則將其分為對照組和實驗組，共5組，每組6只，其中A組為空白對照；B組為術(shù)后6 h（實驗組）；C組為術(shù)后12 h（實驗組）；D組為術(shù)后3 d（實驗組）；E組為術(shù)后7 d（實驗組）。所有大鼠均通過石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核。

1.2 手術(shù)耗材 手術(shù)解剖器械購自上海金鐘手術(shù)器械公司，4-0愛惜康絲線購自強生醫(yī)療器材有限公司，生理鹽水及無菌紗布由石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院提供。

1.3 麻醉及圍手術(shù)期處理 術(shù)前大鼠不做特殊處理，自由飲水和進食，恒溫25～27℃，恒濕45%～55%。麻醉方法如下：將大鼠放入棕色玻璃瓶內(nèi)，往瓶內(nèi)放入浸潤有乙醚的小棉球，待其出現(xiàn)呼吸變慢，活動度明顯降低時，則表示已進入麻醉期，將大鼠取出并將乙醚棉球放于其鼻部，以維持麻醉作用時間。

1.4 手術(shù)方法 各組大鼠均采用肝左外葉部分切除術(shù)，首次切除70%肝葉。對照組立即于尾緣靜脈取血進行丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）水平測定，并且立即再次手術(shù)切除殘存肝左葉蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）；各實驗亞組分別間隔6 h、12 h、3 d、7 d后于尾緣靜脈取血進行ALT、AST生化檢測，并且再次手術(shù)切除殘存肝左外葉，手術(shù)方法如下：本手術(shù)為無菌手術(shù)，所有器械均經(jīng)過高壓滅菌，手術(shù)均在上午11：00～12：00進行，排除手術(shù)操作所引起的誤差；術(shù)前10 h禁食、不禁水，乙醚吸入麻醉，待麻醉平穩(wěn)后仰臥位固定于解剖臺上，常規(guī)備皮，碘酒、乙醇消毒手術(shù)野，鋪巾，沿上腹正中行一長約2 cm縱形切口，依次切開皮膚、肌層和腹膜，自制拉鉤充分暴露手術(shù)野，銳性分離肝周韌帶，游離肝左外葉，輕輕提起，以無齒鑷小心夾住肝左外葉長度約70%處，以阻斷遠端血供，待肝遠端顏色由紅色變?yōu)榘底霞t色，表明血管阻斷成功，此時沿無齒鑷外緣小心切除肝葉，創(chuàng)面使用單極電刀電凝止血，生理鹽水清洗創(chuàng)緣，探查無出血，所剩肝臟血運良好后，采用4-0醫(yī)用絲線進行腹膜和肌層“8”縫合和皮層的單純連續(xù)縫合，關(guān)閉腹腔（圖1）。術(shù)后送回清潔級鼠盒，待大鼠自然蘇醒后即可自由進食進水。術(shù)前、術(shù)中和術(shù)后不用任何抗生素及其他類藥物，手術(shù)平均時長20～25 min，手術(shù)過程中體溫維持在約37℃[5]。各實驗亞組分別間隔6 h、12 h、3 d、7 d，再次沿原切口逐層進腹，輕輕游離粘連組織，充分暴露殘余肝左外葉，并用4號絲線于肝左外葉蒂部結(jié)扎，迅速切除殘余肝左外葉，探查無出血，所剩肝臟血運良好后，原方法關(guān)閉腹腔。術(shù)后送回清潔級鼠盒，待大鼠自然蘇醒后即可自由進食水。術(shù)前、術(shù)中和術(shù)后不用任何抗生素及其他類藥物，手術(shù)平均時長20～25 min，手術(shù)過程中體溫維持在約37℃[5]。術(shù)中無大血管及腹腔臟器損傷等嚴重并發(fā)癥發(fā)生。

1.5 術(shù)后觀察及生理生化指標檢測 （1）觀察對照組及各實驗組大鼠存活率及一般情況：各組初次術(shù)后及二次術(shù)后各個時間點的存活率和病死率，建模后（二次術(shù)后）一周大鼠存活率；（2）對照組及各實驗組大鼠血生化指標檢測：各組大鼠于二次手術(shù)切除殘存肝左外葉前經(jīng)尾緣靜脈取血1 ml，4℃，3000 r/min離心5 min（離心半徑r=10 cm）后取血清，標本送至石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科檢測ALT、AST水平；（3）肝臟組織切片HE染色及病理學(xué)觀察：采用常規(guī)石蠟切片，進行HE染色，光鏡下觀察殘存肝組織病理學(xué)改變，由石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科協(xié)助完成。

圖1 肝左葉70%切除術(shù)造模過程

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 各組大鼠均進入統(tǒng)計分析，中途無遺失，應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以表示，不同時間點ALT和AST分析采用重復(fù)測量方差分析，方差協(xié)方差矩陣是否滿足H型條件的假設(shè)檢驗采用Mauchly球形檢驗，校正系數(shù)用G-Gε；對于不同時間點各檢測指標之間的比較，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 術(shù)后行為學(xué)觀察及存活率統(tǒng)計 與對照組相比，實

驗組二次術(shù)后大鼠毛發(fā)略凌亂、光澤度降低，精神萎靡、嗜睡，活動量減少，對外界刺激反應(yīng)遲鈍。初次及二次術(shù)后所有大鼠均存活，切口愈合良好，無感染滲血等并發(fā)癥的發(fā)生，二次術(shù)后精神、活動及食欲恢復(fù)良好，一周存活率100%，提示可能造模成功。E組二次術(shù)前可見殘肝斷面消失，殘余肝葉幾乎完全恢復(fù)到原體積和結(jié)構(gòu)。

2.2 血液生化檢查 （1）與0 h比較，術(shù)后7 d內(nèi)的ALT水平在術(shù)后7 d達到最低值，逐漸恢復(fù)至0 h水平。重復(fù)測量方差分析顯示，重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差協(xié)方差矩陣不滿足H型條件（χ2=21.928，P＜0.05，G-Gε=0.580）。時間與處理的單獨效應(yīng)顯示：術(shù)后各個時間點ALT均值與0 h比較，6 h、12 h、3 d ALT水平均低于0 h，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），術(shù)后7 d ALT與0 h比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.129，P=0.283）。（2）與0 h比較，術(shù)后7 d內(nèi)的AST水平在術(shù)后7 d達到最低值，逐漸恢復(fù)至0 h水平。重復(fù)測量方差分析顯示，重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差協(xié)方差矩陣不滿足H型條件（χ2=34.601，P＜0.001，G-Gε=0.463）。時間與處理的單獨效應(yīng)顯示：術(shù)后各個時間點AST均值與0 h比較，6 h、12 h、3 d AST水平均低于0 h，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），術(shù)后7 d AST與0 h比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.756，P=0.040，表1）。

2.3 組織病理學(xué)檢查 HE染色病理分析結(jié)果顯示，對照組：肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細胞輪廓清晰，形態(tài)較為規(guī)則，胞漿均勻紅染，細胞核大小正常，核質(zhì)淡染，肝細胞無變性、壞死等；肝細胞索排列整齊并以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰呈多邊形，大小基本一致，小葉間分界清楚，無明顯充血、變形、壞死病理改變。實驗組：可見正常肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)灶狀壞死，肝小葉界限模糊、扭曲變形，中央靜脈偏離或消失，肝細胞索排列紊亂，失去正常放射狀排列，肝細胞變性、壞死，細胞核偏心分布，部分細胞胞核消失，間質(zhì)充血伴有炎性細胞浸潤，肝竇擴張其內(nèi)紅細胞淤積，肝竇腔隙消失，肝臟組織結(jié)構(gòu)明顯破壞（圖2）。

3 討 論

肝臟是機體執(zhí)行解毒和代謝自穩(wěn)態(tài)功能的主要器官[6]，而肝臟病變事對人類健康威脅最嚴重的疾病之一[7,8]，如急性肝損傷。目前學(xué)術(shù)界公認，急性肝損傷是肝實質(zhì)細胞遭到嚴重急性損害的結(jié)果[9]，但其具體機制目前尚未完全闡釋，更不清楚損傷后再生的確切分子機制[10-12]。因此，建立穩(wěn)定、有效的急性肝損傷修復(fù)動物模型是研究其損傷機制、再生及防治的關(guān)鍵性技術(shù)[13,14]。目前從模型的形成機制考慮，可供選擇的急性肝損傷動物模型有很多。常見有藥物性或化學(xué)性損傷模型及實驗手術(shù)模型；然而，采用單純性肝葉部分切除，建立急性肝損傷模型未見報道。

表1 各組大鼠血清ALT/AST濃度水平比較（U/L

表1 各組大鼠血清ALT/AST濃度水平比較（U/L

注：ALT，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶；AST，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶；與0 h比較，①P＜0.05

組別 0 h 術(shù)后6 h 術(shù)后12 h 術(shù)后3 d 術(shù)后7 d F值 P值A(chǔ)LT 38.68±0.40 200.15±1.24① 449.93±1.49① 55.87±0.88① 39.08±0.77 178708.24 ＜0.001 AST 60.97±0.41 257.48±1.19① 755.70±1.00① 75.65±0.33① 62.23±0.29① 957037.84 ＜0.001

圖2 各組大鼠肝臟組織HE染色

與傳統(tǒng)手術(shù)模型相比，本研究所采用的造模方法肝損傷程度小，經(jīng)生理生化檢測滿足模型建立成功的各項指標，并且本研究中造模方法操作簡便，實驗動物存活率高達100%，既有效建立了急性肝損傷模型又達到了實驗動物不致死且高效利用的目的。Higgins 和Anderson[4]創(chuàng)建的全肝2/3（70%）切除，這一模型已在 70 多年的研究中得到了廣泛應(yīng)用[15]，但存在以下缺點：（1）對操作要求較高，需要精確結(jié)扎肝左外葉和右葉根部，易導(dǎo)致肝破裂出血甚至死亡，且不能達到準確的70%肝切除量；（2）由于全肝70%被結(jié)扎后切除，循環(huán)于肝內(nèi)血液也一同丟失而降低了血容量，術(shù)后發(fā)生肝功能衰竭的風(fēng)險也隨之加大，死亡率也隨之加大；（3）當全肝70%切除后，可引起門脈壓力的升高[16]，而出現(xiàn)門脈高壓癥甚至胃腸道淤血，為進一步研究肝損傷帶來了眾多干擾；（4）該方法建立的肝損傷模型，經(jīng)常出現(xiàn)肝臟腔靜脈狹窄和保留肝葉缺血壞死[17,18]；（5）該模型中肝再生不是被切除的肝葉重新長出，而是殘余肝細胞的增生[19]，由于該方法是完整的肝葉切除，因此這種肝再生并不能重新長出被切除的肝左外葉和右葉[4]；（6）實驗取材往往需要處死動物，增加了實驗動物數(shù)量和科研成本，降低了實驗動物的利用率，有違實驗動物倫理核心理論的“3R”原則[20-22]。隨著人類文明的進步，實驗動物的福利及倫理問題引起人們的重視[23]，已在許多國家得到實施和推廣[24,25]，全球每年約有數(shù)十億只動物被用于科學(xué)研究，其中大部分用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[26]，且近多年來，實驗用鼠的數(shù)量約以23%的比例逐年遞增[27]，為此筆者希望在符合科學(xué)真實性原則的情況下，遵循“3R”原則并在科研工作中得到落實和體現(xiàn)。本研究造模后大鼠一周存活率100%，因此模型中的實驗動物還可用于其他技能教學(xué)研究，如清創(chuàng)縫合、切開縫合等外科基本操作外，也可用于胃大部切除術(shù)、脾切除術(shù)、闌尾切除術(shù)、胃-空腸吻合術(shù)等外科手術(shù)實習(xí)，這樣可以在同一只實驗動物上進行互不影響的多項實驗，不僅降低了實驗動物使用量，而且增加實驗動物的利用率，又大大減少了科研財力的消耗。

此外，本研究明確了單純性肝左外葉部分切除，急性肝損傷模型的建立。大鼠肝右葉、肝中葉分別被其內(nèi)的“裂隙”分為右上外葉和右下外葉、右中葉和左中葉；尾狀葉被其內(nèi)的“裂隙”分為上下兩部分[28]，只有左外葉相對“完整”無裂隙，故首選左外葉部分切除，這不僅降低了操作難度，而且極大地提高了操作精確度。肝葉部分切除后的最基本病理變化是肝修復(fù)再生[29]，左外葉70%切除后斷面殘余肝細胞通過有絲分裂形成新細胞，在切除后第7天幾乎完全恢復(fù)了左外葉形狀，很好地誘導(dǎo)了肝急性損傷后的再生修復(fù)；另外，上腹正中切口能更好地顯露肝臟，開腹即所見肝左外葉，避免術(shù)中對肝臟過多地翻動按壓，造成局部微血栓形成，大大降低了潛在風(fēng)險的影響，而且較傳統(tǒng)Pringle法[30,31]相比，有效地避免了肝臟缺血再灌注的損傷和術(shù)后殘肝細胞再生不良[32,33]，術(shù)中肝組織切面平整，剩余肝葉不易感染，同時可顯著降低因結(jié)扎而導(dǎo)致下腔靜脈阻塞的發(fā)生風(fēng)險，與臨床肝段切除術(shù)更接近。

麻醉藥物的選擇也是影響實驗精確度的重要因素，如果麻醉藥物選擇不當可引起實驗動物的不必要死亡。本模型采用乙醚吸入麻醉，有效地避免了水合氯醛和戊巴比妥鈉經(jīng)肝代謝而產(chǎn)生的影響，也避免了對AST和ALT的影響。當肝細胞發(fā)生急性損傷時，肝細胞膜通透性增加，ALT和AST即從細胞內(nèi)逸出，使血液ALT、AST水平升高[34]，在一定程度上反映肝細胞的損傷程度[35]，而血液ALT、AST升高被認為是判斷急性肝損傷嚴重程度的重要指標[36]。有研究顯示在肝損傷12 h時，其血液ALT和AST持續(xù)升高達高峰，12 h后血液ALT、AST 和組織觀察肝臟的損傷程度逐漸降低，并且于第3天逐漸恢復(fù)正常[37]，說明可能隨著肝損傷的逐漸修復(fù)其血液中ALT和AST逐步降低，并且可能處于肝損傷修復(fù)過程中。本實驗過程中，實驗組6 h、12 h、3 d、7 d可見血液中ALT、AST含量顯著增高,提示肝細胞受損嚴重，進一步肝組織病理學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，實驗組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞及肝細胞腫脹、壞死，而對照組肝組織正常。另外，從形態(tài)學(xué)觀察，E組（7 d）于二次術(shù)前肉眼可見殘肝斷面消失、殘余肝葉幾乎完全恢復(fù)到原體積和結(jié)構(gòu)，與Michalopoulos等[15,38]研究相一致。因此，本實驗肝左葉70%切除后，綜合分析血液ALT和AST變化特征并結(jié)合HE染色病理學(xué)改變、行為學(xué)改變、形態(tài)學(xué)改變，考慮該模型可能符合急性肝損傷修復(fù)模型。

總之，本模型采用單純性肝左外葉切除術(shù)，是急性肝損傷再生修復(fù)模型的重要體現(xiàn)。該方法不僅操作簡單、易被各類學(xué)者所掌握，而且實驗動物存活率和模型成功率高；該模型不僅可研究肝損傷、肝再生、肝移植等搭建穩(wěn)定的平臺，而且可對各類干預(yù)措施進行客觀評估。

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