流式細(xì)胞術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)實(shí)習(xí)教學(xué)中的應(yīng)用

鄭美娟

流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometer，F(xiàn)CM)是利用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞或微粒進(jìn)行定量分析及分選的一門生物技術(shù)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)及其他學(xué)科。目前，流式細(xì)胞術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已涵蓋免疫學(xué)、血液學(xué)及腫瘤學(xué)等多個(gè)學(xué)科[1～3]，并成為臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中不可替代的重要診斷技術(shù)，其在疾病的診斷、療效監(jiān)測(cè)及預(yù)后判斷中均具有重要價(jià)值。

醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)是一門理論與實(shí)踐密切相聯(lián)的學(xué)科，實(shí)習(xí)教學(xué)是本專業(yè)的重要教學(xué)階段。醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)尚沒(méi)有開(kāi)設(shè)流式細(xì)胞課程，但是醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的畢業(yè)生無(wú)論進(jìn)入臨床還是從事科研，都需要掌握流式細(xì)胞術(shù)的實(shí)驗(yàn)技能，因此實(shí)習(xí)教學(xué)中補(bǔ)充流式細(xì)胞的相關(guān)知識(shí)顯得尤為重要。本文就醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)實(shí)習(xí)教學(xué)中穿插流式細(xì)胞術(shù)的工作原理、檢測(cè)技術(shù)、開(kāi)展的臨床項(xiàng)目、實(shí)驗(yàn)操作及質(zhì)量控制等內(nèi)容進(jìn)行初步探討。

1 流式細(xì)胞術(shù)理論講述

為了讓醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)的學(xué)生更好的掌握流式細(xì)胞術(shù)，首先要讓他們了解其檢測(cè)原理。流式細(xì)胞術(shù)是集激光技術(shù)、電子技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)以及免疫學(xué)技術(shù)為一體的一門新實(shí)驗(yàn)技術(shù)，它利用一定的壓力把單細(xì)胞混懸液壓入流動(dòng)室，使兩側(cè)鞘液以一定的角度噴出并包裹單細(xì)胞懸液通過(guò)激光照射的區(qū)域，F(xiàn)CM通過(guò)收集待測(cè)細(xì)胞標(biāo)記的熒光信號(hào)和光學(xué)信號(hào)，進(jìn)而對(duì)待測(cè)細(xì)胞進(jìn)行定性以及定量的分析。在實(shí)習(xí)教學(xué)中，為了進(jìn)一步加深同學(xué)們理解流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)原理，我們利用多媒體教學(xué)手段向同學(xué)講解，制作形象動(dòng)畫形式講解流式細(xì)胞的原理及流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)，并向同學(xué)們介紹相關(guān)的流式細(xì)胞書籍以及文獻(xiàn)資料。

2 流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)介紹

在給同學(xué)們?cè)敿?xì)講述流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)原理的基礎(chǔ)上，接下來(lái)我們引入FCM的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行介紹。目前科研及臨床涉及的技術(shù)主要包括表型分析技術(shù)、定量檢測(cè)技術(shù)、可溶性蛋白檢測(cè)技術(shù)以及細(xì)胞分選技術(shù)。FCM進(jìn)行表型分析主要是依據(jù)細(xì)胞表面或內(nèi)部的特異表達(dá)抗原，并應(yīng)用熒光標(biāo)記的單克隆抗體分析目的細(xì)胞的特征。而定量檢測(cè)技術(shù)是通過(guò)流式細(xì)胞儀獲得精確、可重復(fù)的絕對(duì)值計(jì)數(shù)，利用絕對(duì)值計(jì)數(shù)管定量待測(cè)淋巴細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)目，例如HIV患者可計(jì)數(shù)CD4+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)目[4]?？扇苄缘鞍讬z測(cè)技術(shù)是近年發(fā)展起來(lái)的流式細(xì)胞術(shù)微球陣列法(Cytometric bead array，CBA)，可用較少的標(biāo)本量檢測(cè)多種細(xì)胞因子，已廣泛利用CBA技術(shù)檢測(cè)多種細(xì)胞因子，例如Th1、Th2及Th17類細(xì)胞因子及其他細(xì)胞因子[5]。細(xì)胞分選技術(shù)是指流式細(xì)胞儀根據(jù)分析細(xì)胞的特性并能夠特異分選某一細(xì)胞亞群[6]。分選型流式除了分選特定細(xì)胞亞群，也可用于分選病毒[2]。

3 流式細(xì)胞術(shù)在臨床中開(kāi)展的項(xiàng)目

流式細(xì)胞術(shù)從基礎(chǔ)科學(xué)研究逐步擴(kuò)展到多個(gè)領(lǐng)域，主要涉及腫瘤、血液系統(tǒng)疾病以及免疫相關(guān)疾病等，尤其在血液系統(tǒng)疾病的診療中具有重要作用[7]。目前，流式細(xì)胞開(kāi)展的臨床項(xiàng)目除了可以檢測(cè)各類細(xì)胞，亦可以檢測(cè)血小板、病原微生物及人工合成微球等。其檢測(cè)的具體內(nèi)容包括細(xì)胞膜、細(xì)胞核和胞質(zhì)中各種抗原分子的定性和定量分析、核酸（DNA和RNA）定量分析以及細(xì)菌耐藥等方面的分析。我們于2011年和2017年分別引入BD FACS CaliburTM以及BD FACS CantoTM 流式細(xì)胞儀，利用流式細(xì)胞儀已開(kāi)展臨床檢測(cè)項(xiàng)目有白血病免疫分型、淋巴瘤、微小殘留、淋巴細(xì)胞亞群、絕對(duì)計(jì)數(shù)、HLA-B27、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、血小板自身抗體、封閉抗體、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及細(xì)胞因子等項(xiàng)目的檢測(cè)。針對(duì)一些臨床開(kāi)展的項(xiàng)目，我們選擇檢驗(yàn)科流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室收集的典型病歷的流式診斷報(bào)告給學(xué)生進(jìn)行病例分析。

4 流式細(xì)胞術(shù)的實(shí)驗(yàn)操作

結(jié)合醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)的情況，我們采用理論聯(lián)系實(shí)際的辦法，為學(xué)生設(shè)計(jì)了我們檢驗(yàn)科利用流式細(xì)胞術(shù)開(kāi)展的臨床項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)。通過(guò)給學(xué)生設(shè)計(jì)流式細(xì)胞技術(shù)的實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練，可促進(jìn)同學(xué)們理解流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)原理以及實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)。最重要的是流式技術(shù)訓(xùn)練可讓學(xué)生熟練掌握這門技術(shù)，比如上機(jī)檢測(cè)中如何進(jìn)行流式參數(shù)的設(shè)置、檢測(cè)結(jié)果的處理分析以及檢驗(yàn)報(bào)告的發(fā)布等，從而提高醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)生在日后工作中進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)的能力。除了要求醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)生掌握臨床項(xiàng)目的檢測(cè)及分析技能，我們還在學(xué)生的實(shí)踐練習(xí)中引入流式細(xì)胞技術(shù)相關(guān)的科研內(nèi)容。通過(guò)向同學(xué)們講述流式細(xì)胞技術(shù)在科研中的應(yīng)用，我們鼓勵(lì)學(xué)生在感興趣課題中引入流式細(xì)胞技術(shù)，幫助同學(xué)們進(jìn)行流式相關(guān)的實(shí)驗(yàn)探索和設(shè)計(jì)，培養(yǎng)學(xué)生的科研思維。我們給學(xué)生培訓(xùn)的流式細(xì)胞技能包括淋巴細(xì)胞亞群分析及定量檢測(cè)、HLA-B27檢測(cè)以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測(cè)等。如，讓學(xué)生動(dòng)手進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)：首先是標(biāo)本采集，使用EDTA-K2抗凝真空采血管，抽取靜脈血2 mL；然后進(jìn)行細(xì)胞染色，流式管中加入CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP-Cy5.5/CD4-APC抗體，再加入全血100L，混勻后置室溫避光孵育15min；加入FACSLysing溶血液2.0 mL，置室溫避光孵育10 min；300 g離心5 min，棄上清液；PBS洗滌細(xì)胞2次，300 g離心5 min，棄上清液；300L PBS重懸上機(jī)檢測(cè)；流式軟件分析結(jié)果并準(zhǔn)備流式檢測(cè)報(bào)告。

5 流式細(xì)胞術(shù)的質(zhì)量控制

流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量控制也尤為重要。FCM的質(zhì)量要求是使檢測(cè)報(bào)告最真實(shí)的反應(yīng)患者的患病情況或者無(wú)病狀態(tài)，這同時(shí)也是實(shí)驗(yàn)室能對(duì)臨床要求最大的滿足。因此有必要讓同學(xué)們了解流式細(xì)胞的質(zhì)量控制。研究表明流式實(shí)驗(yàn)中采用穩(wěn)定的已知質(zhì)控物，可保證免疫表型檢測(cè)的結(jié)果可靠[8～9]。我們進(jìn)行流式實(shí)驗(yàn)檢測(cè)前，分別用Flow-Check微球以及Flow-Set熒光微球校準(zhǔn)流式細(xì)胞儀的光路與流路、光電倍增管。為了控制實(shí)驗(yàn)的精密度，使用全血質(zhì)控品或質(zhì)控品干粉進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制。此外，作為室內(nèi)質(zhì)量控制的補(bǔ)充，我們積極參加衛(wèi)生部臨檢中心每年舉辦的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)，以控制流式實(shí)驗(yàn)室工作的準(zhǔn)確度。

6 結(jié) 語(yǔ)

隨著流式細(xì)胞儀的性能日臻完善，流式細(xì)胞技術(shù)在科研以及臨床診斷中的重要價(jià)值愈發(fā)凸顯，因而醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)的同學(xué)有必要得到流式細(xì)胞新技術(shù)的錘煉。我們選擇醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)實(shí)習(xí)期的同學(xué)，在實(shí)習(xí)過(guò)程中進(jìn)行流式細(xì)胞技術(shù)的相關(guān)教學(xué)，使學(xué)生掌握這門新技術(shù)并能夠分析流式細(xì)胞檢測(cè)報(bào)告，同時(shí)幫助學(xué)生拓展科研思路，促使流式細(xì)胞技術(shù)平臺(tái)更深入的應(yīng)用于科研和臨床工作，有效推進(jìn)科研人才的培養(yǎng)和臨床工作人員技能的提高。

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