3D打印在生物醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用及醫(yī)學(xué)案例

3D打印技術(shù)誕生于20世紀(jì)90年代中期，是一種基于計算機(jī)3D數(shù)字成像技術(shù)和多層連續(xù)打印的新興技術(shù)。3D打印技術(shù)結(jié)合了光固化和紙層疊等技術(shù)，用于物件的快速成型。近年來，3D打印技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域取得了突飛猛進(jìn)的進(jìn)展。

一、組織工程學(xué)中的技術(shù)進(jìn)展

組織工程學(xué)的目標(biāo)是為再生療法創(chuàng)造功能性組織和器官，最終實現(xiàn)器官移植或置換。研究人員在可再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域不斷的試錯以驗證技術(shù)的可行。研究人員在長期對自然人體組織觀察后提出了一份要求清單。他們指出，如果希望人造組織像人體內(nèi)的自然組織那樣起作用，那么人造組織就必須：①通過微縫、膠水[1]或細(xì)胞粘[2]附實現(xiàn)與自然組織的整合；②在體內(nèi)實現(xiàn)組織基本功能[3]；③完全血管化以維持其生理功能[4]。

此外，用于組織制造的打印機(jī)也需要標(biāo)準(zhǔn)化：①生物打印機(jī)需要設(shè)定極端的滅菌方法；②密切監(jiān)測濕度和溫度等因素以達(dá)到生物打印的理想條件；③理想的噴嘴尺寸和輸送方式。

1.熱噴墨生物打印[5]

研究人員修改了典型的噴墨打印機(jī)，以便為組織材料提供便利的特殊打印頭。印刷臺或接收托盤也被修改為在三維空間（x，y，z方向）上移動。選擇用于組織制造的打印機(jī)之一是具有300 dpi打印分辨率的Hewlett Packard（HP）Deskjet 500熱敏式噴墨打印機(jī)。研究人員使用通道直徑更小的噴嘴與該打印機(jī)結(jié)合使用。用“生物墨水”替代了普通墨水。這種“生物墨水”是一種由蛋白質(zhì)、酶和懸浮在培養(yǎng)基或鹽水中的細(xì)胞組成的水基液體。

噴墨打印機(jī)從上到下逐層打印生物組織?？墒褂脪呙璧腃T或者M(jìn)RI圖像引導(dǎo)進(jìn)行3D打印。流體液滴作為先前設(shè)計的圖案的點對點表示被噴射到打印表面上。熱噴墨打印機(jī)還可以使用熱量生成能在針頭內(nèi)破裂的小氣泡，以提供將生物體排出噴嘴的壓力脈沖。過高的溫度將破壞生物細(xì)胞，因此打印機(jī)內(nèi)溫度控制為高于環(huán)境溫度4～10℃，以保證90%的生物細(xì)胞活性。噴出噴頭的生物墨水的劑量根據(jù)溫度梯度、電流頻率和生物墨水粘度可從10～150pL變化。

目前已經(jīng)能打印出生物軟骨以替代傳統(tǒng)的可降解支架。通過蛋白多糖和II型膠原中的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）沉積，已經(jīng)能使生物軟骨在聚乙二醇（PEG）巨噬細(xì)胞內(nèi)保持活力。利用PEG水凝膠的可調(diào)節(jié)壓縮模量，能打印出和人類自然軟骨相容的生物軟骨。但這種無血管和非淋巴結(jié)的組織不足以產(chǎn)生更高水平的功能性組織構(gòu)建體，如腎臟和其他復(fù)雜器官。但通過人類微血管內(nèi)皮細(xì)胞和纖維蛋白同時沉積形成微血管系統(tǒng)，使得在人類微血管制造中使用熱噴墨打印機(jī)具備潛力。

2.直寫生物打印

直寫生物打?。╠irect-write bioprinting）與熱噴墨打印技術(shù)具有相同機(jī)制。打印機(jī)頭由標(biāo)準(zhǔn)注射器或針頭制成，并被修改為使用機(jī)械或氣動功率來分配生物體。打印階段的運動受數(shù)字控制，并在x、y和z方向上移動。直寫式打印機(jī)的生物學(xué)特征可以由不同濃度的水凝膠組成，其由瓊脂糖、藻酸鹽、I型膠原蛋白和Pluronic F127組成。所有這些水凝膠聚合物在體外培養(yǎng)時已經(jīng)成功地保持高的細(xì)胞活力。

打印機(jī)可由數(shù)字獨立控制進(jìn)行多個印刷單元并加載材料，因而能夠打印具有不同組成成分的組織。直接寫入生物打印也可以在一定劑量內(nèi)控制打印材料，并允許在打印中進(jìn)行設(shè)計修改，意味著打印組織具有更快的周轉(zhuǎn)時間。

目前有3種直接寫入打印的方法：氣動、機(jī)械、氣動-機(jī)械混合。氣動系統(tǒng)使用高粘度材料更好地工作，而機(jī)械系統(tǒng)更適合于用更低粘度材料。材料粘度是許多因素的函數(shù)，包括膠凝機(jī)理、聚合物分子量、聚合物濃度、溫度、交聯(lián)劑活性和濕度。生物印刷線的物理尺寸也是許多變量的結(jié)果，包括針直徑、材料流速、印刷線高度和線性寫入速度。根據(jù)圖案，所分配的材料的線寬和高度對于制造可能是至關(guān)重要的。需要時間為水凝膠制備最佳條件，并且在規(guī)劃較大結(jié)構(gòu)的制造時必須考慮在非最佳溫度或濕度下，材料性質(zhì)和細(xì)胞存活力都可能產(chǎn)生的負(fù)面影響。因此，為了選擇分配印刷材料的最佳方法，必須考慮所需的粘度、線寬和高度，圖案以及進(jìn)行印刷的條件，通過確定使用材料所需的最佳條件來最小化變量。

3.橢球體器官打印

一般來說，組織制造是通過可塑性支架與“模具和填充”方法進(jìn)行。然而，3D多孔支架中多種細(xì)胞的精確放置過程是非常復(fù)雜的，并且支架遺留下來的材料會在體內(nèi)降解時刺激機(jī)體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。將體外細(xì)胞接種到固體可生物降解的支架上，等待支架生物降解和組織新形態(tài)發(fā)生的過程非常耗時，工作量大且成本高，無法實現(xiàn)量產(chǎn)。研究人員認(rèn)為，更先進(jìn)的方法必須能夠以高水平的細(xì)胞密度精確放置細(xì)胞，并且需要實現(xiàn)厚層3D組織的有效血管化，利用工業(yè)規(guī)模的自動化/機(jī)器人生物制造方法，而非基于模板的組織裝配。由此研究人員開發(fā)出球體器官打印技術(shù)。這種技術(shù)能夠自組裝和就地結(jié)構(gòu)化，不使用可降解支架即可保持形狀。

橢球體（spheroid）是一種可測、可進(jìn)化、成分可控的生物體。當(dāng)橢球體互相靠近時，將會像液體一般產(chǎn)生自融合。因此具備自組裝和自組織的潛力。

通過使用不同類型的橢球體，能制造出具有內(nèi)置血管分支的器官。研究人員制造了3種類型的球狀體，以創(chuàng)建血管分支：固體或非內(nèi)腔球體、具有大管腔（單腔管球體）的球體和微血管化組織球體?？梢酝ㄟ^同時放置所有3個血管球體，有效地構(gòu)建大直徑、中等直徑和微直徑的不同血管分支。在生物打印、融合、組織成熟后，血管分支能整合到其他3D組織或器官構(gòu)建體中。目前，這種技術(shù)仍然在研究中。

目前3D打印在組織工程學(xué)中的限制主要在于：

（1）血管化

為了創(chuàng)造一個完整和有功能的器官，研究人員必須能夠創(chuàng)造出具有各種血管結(jié)構(gòu)和微結(jié)構(gòu)的完全血管化的厚復(fù)合組織，以維持周圍的組織器官。但目前實現(xiàn)起來仍然比較困難。當(dāng)前血管化的主要手段是將生物機(jī)體的毛細(xì)血管向移植器官內(nèi)滲透[6]，但這一方法缺乏控制和特殊性（specificity），并且血管的滲透深度有限，滲透過程容易導(dǎo)致滲透區(qū)域發(fā)生變形，造成組織破壞。因此更理想的方式是在器官移植前進(jìn)行血管化。

（2）組織成分和成本

除血管化外，天然組織還含有獨特的細(xì)胞組合和組織。需要開發(fā)模擬天然組織復(fù)雜性的技術(shù)，以驅(qū)動組織恢復(fù)和替代醫(yī)療應(yīng)用；另外，生產(chǎn)器官工作量十分巨大，如腎臟需要產(chǎn)生至少一百萬個腎小球和腎單位。同時，制造的組織必須是可擴(kuò)展的，這在目前無法達(dá)到。最后，生產(chǎn)成本是一個無法避免的挑戰(zhàn)。

二、生物醫(yī)用3D打印材料

生物醫(yī)用領(lǐng)域的3D打印材料主要包括金屬、陶瓷、高分子材料和活體細(xì)胞等。

1.金屬

金屬材料具有良好的強(qiáng)韌性、耐疲勞性以及延展性，使其成為醫(yī)學(xué)上應(yīng)用最廣泛的一類生物醫(yī)用材料，主要用于骨骼、牙齒和血管等組織器官的治療[7]。金屬的熔融溫度比較高，打印的難度較大，所以金屬3D打印一般采用光固化立體印刷（SLA）和選擇性激光燒結(jié)（SLS）方式加工，由金屬粉末在紫外光或者高能激光的照射下產(chǎn)生的高溫實現(xiàn)金屬粉末的熔合，逐層疊加得到所需的部件[8]。目前用于生物醫(yī)學(xué)3D打印的金屬材料主要有鈦合金、鈷鉻合金、不銹鋼和鋁合金等，已有醫(yī)學(xué)研究人員利用鈦合金材料打印出人造骨骼，并成功植入人體。但是，該技術(shù)的缺點適用于3D打印的金屬材料昂貴，患者難以承擔(dān)高昂的費用，無法實現(xiàn)全面推廣。雖然金屬材料因其良好的特性在醫(yī)用領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，但是金屬材料料植入后受到腐蝕和磨損而使綜合性能變差、發(fā)生炎癥反應(yīng)等，并且金屬中含有對人體有毒性的合金元素，以及金屬材料植入件與生物體之間的匹配程度等問題是目前3D打印醫(yī)用金屬材料需要解決的問題。

2.陶瓷

陶瓷材料具有低密度、高強(qiáng)度、高硬度、耐高溫、耐腐蝕、化學(xué)穩(wěn)定性好的特性，主要應(yīng)用在口腔和骨骼等硬組織器官中。主要使用的陶瓷材料有磷酸鈣、磷酸二正硅酸鈣、雙相磷酸鈣、硅酸鈣/β-磷酸三鈣等材質(zhì)的生物陶瓷，并根據(jù)生物陶瓷在生物體內(nèi)的活性分為惰性生物陶瓷、活性生物陶瓷及可吸收生物陶瓷3大類[9]。硅酸鈣陶瓷具有很好的生物活性和誘導(dǎo)沉積類骨經(jīng)基磷灰石層的能力。羥基磷灰石生物陶瓷植入人體后，其多孔結(jié)構(gòu)有利于血液循環(huán)，血液通過其微孔結(jié)構(gòu)為羥基磷灰石深部的新生骨提供營養(yǎng)，促進(jìn)纖維組織和新生骨的結(jié)合和生長，是一種性能優(yōu)異的硬骨組織替代材料[10]。雙相磷酸鈣陶瓷是由羥基磷灰石和磷酸鈣按一定比例組成的混合物，具有良好的生物相容性、生物活性及可降解性。西安交通大學(xué)的郭大剛研究團(tuán)隊利用快速成型模板成功調(diào)制雙相摻鍶磷酸鈣陶瓷骨支架，這種陶瓷支架在保證強(qiáng)度的同時提高了可降解性[11]。陶瓷材料脆而硬的特點，加大了其加工成型的難度。因此，3D打印陶瓷材料時多使用激光燒結(jié)法可將黏合劑粉末熔化，并使之與陶瓷粉末黏合[12]。同時，陶瓷材料脆而硬的特點也是限制其在生物醫(yī)用領(lǐng)域的3D打印技術(shù)中具有更廣泛應(yīng)用的因素之一。納米技術(shù)有望改進(jìn)生物陶瓷材料的這一缺點。研究人員在研究改變陶瓷材料成分配比的同時，將納米技術(shù)納入研究，以制備3D打印所需的生物應(yīng)用陶瓷粉末。

3.高分子材料

在生物醫(yī)療領(lǐng)域，金屬材料與高分子材料是被采用最多的2種醫(yī)用材料。醫(yī)用高分子材料一般常用于制成直接用于人體的醫(yī)療用品、藥用高分子和人工器官等。因此，這類材料除具有良好的加工性能和物理機(jī)械性能之外，還必須具有優(yōu)良的生物相容性[13]。除此之外，由于3D打印技術(shù)的“墨水”需要粘合劑成分，用于3D打印的醫(yī)用高分子材料往往需要很高的固化速度、固化收縮率等。生物醫(yī)用高分子材料種類眾多，其中聚乳酸、聚丙烯腈和聚四氟乙烯等是最常用的幾種高分子聚合物[14]。2002年，Malcolm N.Cooke等[15]人提出了一種利用SLA技術(shù)制造用于組織工程的可生物降解聚合物支架的新方法。該實驗使用富馬酸二乙酯（DEF）、聚（富馬酸丙烯酯）（PPF）和光引發(fā)劑、雙?；趸ⅲ˙APO）的生物可降解樹脂混合物作為原材料，成功制造了可用于骨基質(zhì)的組織工程支架。目前，關(guān)于生物醫(yī)用高分子材料的研究和實際應(yīng)用案例眾多，但是在生物醫(yī)用3D打印高分子材料領(lǐng)域的研究還處于初步階段。3D打印機(jī)利用醫(yī)用高分子材料制造的成本比較高，如何保障高分子材料在滿足醫(yī)療使用所需的性能的同時，降低成本，是目前研究人員要重點攻破的難關(guān)。

4.活體細(xì)胞

活體細(xì)胞可作為3D生物打印材料直接打印人體組織器官。在組織工程支架領(lǐng)域，研究人員利用3D打印技術(shù)制造組織工程支架，精確控制孔徑大小與細(xì)胞匹配，使細(xì)胞更好地粘附在支架上，促進(jìn)細(xì)胞增殖。而直接使用活體細(xì)胞進(jìn)行打印，利用3D打印技術(shù)控制細(xì)胞在微觀尺度的排列分布，相比于在已成型的支架中種植細(xì)胞，直接攜帶細(xì)胞打印可以獲得更高的細(xì)胞密度。但是，細(xì)胞體外培養(yǎng)需要外基質(zhì)的支撐，因此細(xì)胞3D打印的材料是均勻的細(xì)胞/細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)合物[16]。水凝膠與天然軟組織細(xì)胞外基質(zhì)在結(jié)構(gòu)、組成和力學(xué)性質(zhì)上相似，具有高度膨脹的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，有效包裹細(xì)胞的能力，良好的生物活性以及高效的傳質(zhì)能力。可以提供分子定制的生物功能和可調(diào)節(jié)的機(jī)械性質(zhì)，以及用于細(xì)胞生長和組織形成的細(xì)胞外基質(zhì)樣微環(huán)境，使其成為常用的細(xì)胞3D打印的細(xì)胞外基質(zhì)。水凝膠的制備材料包括天然、合成和天然/合成復(fù)雜聚合物等各種聚合物材料[17]。常見的包括海藻酸鹽、明膠、纖維蛋白膠、膠原、透明質(zhì)酸、聚富馬酸丙二醇酯（PPF）、聚氨酯（PU）、聚氧乙烯（PEO）等。2013年，赫瑞瓦特大學(xué)團(tuán)隊Alan FaulknerJones等[18]開發(fā)了用于形成人體胚胎干細(xì)胞球狀體聚集體的細(xì)胞打印機(jī)，并成功利用該打印機(jī)使用人體人體胚胎干細(xì)胞打印出人造肝臟組織。但是目前細(xì)胞3D打印的組織器官的存活周期短，還有待進(jìn)一步的研究。

三、成功醫(yī)學(xué)案例[19]

Stratasys旗下的增材制造服務(wù)公司 Stratasys Direct Manufacturing利用3D打印制造出腦模型；位于美國加利福尼亞州的Spinal Elements公司正在制訂脊柱外科手術(shù)指南；2016年，一項耗時27h的手術(shù)通過3D打印得到成功實施。手術(shù)在3D System的3D打印器械支持下，對一對連體嬰兒成功進(jìn)行了分離。

3D打印醫(yī)學(xué)領(lǐng)域雖然尚未實現(xiàn)商業(yè)化，但已經(jīng)可以預(yù)見出良好的發(fā)展?jié)摿ΑＱ芯咳藛T表示，如果將3D system公司的3D打印器材與生物相容性材料結(jié)合，將可以在醫(yī)院中進(jìn)行穩(wěn)定使用。

紐約費恩斯坦醫(yī)學(xué)研究所教授Daniel A.Grand將再生醫(yī)學(xué)稱為“組織工程V2.0”。Grant在發(fā)表在Nature上的風(fēng)濕病學(xué)綜述中解釋了3D生物打印將矯形治療提升到下一個等級，特別是通過軟骨的制造的方法。針對骨折的修復(fù)，國際上正在研究可進(jìn)行3D打印的生物墨水。生物墨水的材料包括蠶絲和陶瓷。位于伊利諾伊州的西北大學(xué)制造出了有著具有超彈性質(zhì)的3D打印鈣塑骨。這種骨骼在機(jī)械測試中表現(xiàn)出了良好的特性，同時有著很好的生物相容性。英國紐卡斯?fàn)柎髮W(xué)的Mancuso[20]描述了一種3D生物打印技術(shù)和燒結(jié)技術(shù)的組合。研究人員成功利用3D打印技術(shù)制造出了一種生物陶瓷結(jié)構(gòu)，能很好地與皮質(zhì)骨的特性相匹配。2016年底，在中國國家高技術(shù)研究與發(fā)展計劃中，3D打印已經(jīng)成功實現(xiàn)靜脈組織植入活恒河猴體內(nèi)。這是臨床實驗前的第一步，實驗最終在于在人體上獲得成功。馬薩諸塞州東北大學(xué)和佐治亞理工學(xué)院的研究人員也開發(fā)了新型3D打印血管的方法。生物科技公司Celprogen展示了一個微型3D打印的心臟，這種人造心臟可以在充滿血液時跳動。然而，事實是血管組織由多種類型的細(xì)胞組成，因此組織的重建只有通過材料和方法的組合才有可能實現(xiàn)。

2016年，歐萊雅與Organovo簽訂合同，再次提供用于實驗的生物材料時，針對類似目的的商業(yè)驗證也隨之出現(xiàn)。Organovo的CEO認(rèn)為3D生物打印的市場價值在100億美元。劍橋大學(xué)的Yan Yan Shery Huang是馬斯特里赫特生物3D打印會議的另一位演講者。她的研究小組“Biointerface”涉及器官芯片技術(shù)和電控的3D生物打印，其研究是劍橋大學(xué)英國癌癥研究中心的一部分。3D生物制品和芯片實驗室技術(shù)將如何影像患者的健康還有待進(jìn)一步的研究。2017年，伯明翰阿拉巴馬大學(xué)的研究人員Borovjagin指出3D生物制造出一個完整的心臟可能是最合理的方法[21]。作者還概述了合成貼片對于這種復(fù)雜器官是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足的，因此該方法將取代目前還在不斷探索研究的模塊化方法。由于能夠復(fù)制心臟對物質(zhì)的反應(yīng)，即使沒有動物實驗，哈佛的3D打印心臟芯片模塊和其他芯片實驗室技術(shù)研究的未來也是樂觀的。

3D打印技術(shù)將帶動醫(yī)學(xué)進(jìn)入新的發(fā)展時代，成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點。美國、德國、以色列、英國、日本等國家正在加大對3D打印技術(shù)的投入。目前，我國也正在不斷加速對3D打印技術(shù)的研究。在3D打印人造器官技術(shù)研究方面，現(xiàn)在已經(jīng)達(dá)到國際先進(jìn)水平。如今，生物醫(yī)用領(lǐng)域的3D打印技術(shù)應(yīng)用，可謂是機(jī)會與問題并存。尤其是在3D打印人造器官技術(shù)方面，由于人體組織器官結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和功能的多樣性，諸多問題有待解決，例如單細(xì)胞、多種細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)簇的受控三維空間輸送、精準(zhǔn)定位、排列與組裝，生物制造過程中對細(xì)胞的損傷及生物功能的影響，以及3D生物打印機(jī)的噴頭設(shè)計等。這也是生物醫(yī)用3D打印技術(shù)未來研究的主要方向。

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