骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體改善缺氧誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷與STAT3的相關(guān)性

范 林， 孫石峰， 江 瓊， 李烈友， 馮志海， 陳 煌， 陳良龍

血管內(nèi)皮損傷是眾多缺血性疾病的共同病理基礎(chǔ)，有效阻止和減輕內(nèi)皮損傷對(duì)延緩缺血性疾病的發(fā)展進(jìn)程具有重要意義。既往研究顯示，干細(xì)胞外泌體能夠減輕各種因素刺激下的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，但多聚焦于傳遞治療性微小RNA[1-3]。對(duì)于是否能夠通過傳遞蛋白發(fā)揮保護(hù)性作用，目前尚不明確。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription, STAT3)是STAT家族成員之一，作為重要的轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞內(nèi)起著信號(hào)傳遞作用，當(dāng)受到細(xì)胞外信號(hào)刺激，活化的JAK，ERK1/2和Akt1能夠與STAT3蛋白的相應(yīng)位點(diǎn)(如Y705，S727)結(jié)合，磷酸化修飾STAT3并使之活化，活化的STAT3以二聚體形式進(jìn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)靶基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞功能。研究表明，STAT3介導(dǎo)了干細(xì)胞的心血管保護(hù)效應(yīng)，人子宮內(nèi)膜干細(xì)胞移植能夠增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及內(nèi)皮管形成能力[4]。近來(lái)，國(guó)外學(xué)者通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)來(lái)源的外泌體中含有大量蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子等蛋白分子，包括STAT3[5]。但干細(xì)胞外泌體能否通過傳遞STAT3蛋白發(fā)揮內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用尚不明確。本研究擬采用攜帶綠色熒光蛋白(green fluorescence protein, GFP)的慢病毒轉(zhuǎn)染標(biāo)記大鼠骨髓MSCs，采用缺氧無(wú)血清培養(yǎng)構(gòu)建內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，探討干細(xì)胞外泌體減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要材料 Sprague Dawley(SD)大鼠骨髓MSCs(BNCC100382)和大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(rat aorta endothelial cell, RAEC)(BNCC341217)(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)；攜帶GFP的慢病毒原液(2×108轉(zhuǎn)導(dǎo)單位/mL)(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)；低糖DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；外泌體提取試劑盒(美國(guó)Invitrgon公司)；重組抗CD9抗體(ab92726)、重組抗CD81抗體(ab109201)、重組抗STAT3抗體(ab68153)、重組抗STAT3 (phospho Y705)抗體(ab76315)、重組抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)抗體(ab32152)、重組抗血管生成素2(angiopoietin 2/Ang2)抗體(ab155106)、抗缺氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)抗體(ab216842)(均為英國(guó)ABCAM公司產(chǎn)品)；重組抗CD63抗體(OM245785)(美國(guó)OmnimAbs公司)；BCA法蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；cDNA合成試劑盒(美國(guó)Promega公司)；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒(美國(guó)Bimake公司)。

1.2方法

1.2.1構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)GFP的大鼠骨髓MSCs 以每孔2.5×105個(gè)細(xì)胞的密度接種大鼠骨髓MSCs于6孔板，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中，以含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)30%～40%融合度時(shí)，以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)為15的重組慢病毒進(jìn)行感染，48 h后通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)，再以5 μg/mL嘌呤霉素篩選感染48 h后的細(xì)胞，每2天換液1次，以未做病毒感染處理的細(xì)胞為對(duì)照；篩選后的細(xì)胞在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h(培養(yǎng)條件同上)，熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況，并于細(xì)胞達(dá)80%～90%融合度時(shí)傳代凍存。

1.2.2外泌體提取與掃描電鏡鑒定 將穩(wěn)定表達(dá)GFP的大鼠骨髓MSCs接種于10 cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞增殖至80%融合度時(shí)，更換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，放入?yún)捬跖囵B(yǎng)盒中缺氧培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞上清，以外泌體分離提取專用試劑盒提取外泌體，具體按試劑盒說(shuō)明書操作。提取的外泌體以鋨酸溶液4 ℃固定，乙醇梯度脫水后丙酮包埋，將包埋板置于65 ℃下聚合48 h，然后以醋酸雙氧鈾和醋酸鉛各染色10 min，清洗后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3大鼠RAEC缺氧模型的建立與分組 取長(zhǎng)勢(shì)良好的RAEC 細(xì)胞，胰酶消化，接種量為24 h后達(dá)70%的融合度為宜。細(xì)胞分為3組：對(duì)照組、缺氧組和外泌體+缺氧組。細(xì)胞置于厭氧培養(yǎng)盒中以無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)構(gòu)建細(xì)胞缺氧模型，具體培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)而定，以正常條件培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照。外泌體工作終濃度為50 μg/mL。

1.2.4CCK-8檢測(cè)RAEC細(xì)胞的增殖活性 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的RAEC細(xì)胞，按每孔3×103個(gè)接種，每孔100 μL完全培養(yǎng)基，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，吸棄原培養(yǎng)基，根據(jù)分組要求，加入相應(yīng)培養(yǎng)液進(jìn)行干預(yù)，分別于24,48及72 h后取出，細(xì)胞每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h后取出，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)OD值。

1.2.5黏附實(shí)驗(yàn) 用10 μg/mL的纖連蛋白預(yù)鋪96孔板，每孔100 μL，4 ℃過夜，用1% BSA于37 ℃封閉1 h。取分組干預(yù)48 h后的RAEC細(xì)胞，按每孔5×103個(gè)接種，每孔100 μL完全培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37 ℃孵育1 h，PBS洗去未黏附的細(xì)胞；4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗滌 3遍；加入100 μL的姬姆薩染料染色15 min，PBS洗滌后，在光鏡200倍視野下隨機(jī)選取6個(gè)不同視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.6Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶，按分組要求加入相應(yīng)培養(yǎng)液干預(yù)48 h后，收集細(xì)胞并調(diào)整密度為每室5×104個(gè)接種于小室中，加入無(wú)血清培養(yǎng)基200 μL，下室加入500 μL完全培養(yǎng)基(含10% FBS)，將帶有小室的24孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2)中培養(yǎng)，18 h后取出，PBS洗滌，每孔加入預(yù)冷的500 μL固定液固定20 min，以結(jié)晶紫500 μL染色30 min，PBS洗滌3次；在倒置顯微鏡400倍視野下隨機(jī)選取6個(gè)不同視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.7內(nèi)皮管形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞接種于T25培養(yǎng)瓶，加入相應(yīng)培養(yǎng)液干預(yù)48 h，以每孔3×104個(gè)細(xì)胞加入鋪有Matrigel的96孔板中，每孔100 μL完全培養(yǎng)基，每組3個(gè)復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)12 h(每隔一段時(shí)間觀察)，選取最佳成管時(shí)間；在倒置顯微鏡100倍視野下觀察內(nèi)皮管形成效果，并隨機(jī)選取視野拍照計(jì)算成管個(gè)數(shù)。

1.2.9qRT-PCR法檢測(cè)VEGF，Ang-2和HIF-1基因mRNA表達(dá) 細(xì)胞干預(yù)同Western-blot實(shí)驗(yàn)，提取總RNA，以Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第1鏈，以β-actin為內(nèi)參照，使用qRT-PCR試劑盒及特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，所有特異性引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)引物序列

2 結(jié) 果

2.1大鼠骨髓MSCs熒光表達(dá)及其外泌體形態(tài)和蛋白表達(dá) GFP穩(wěn)定表達(dá)的大鼠骨髓MSCs培養(yǎng)3 d后，細(xì)胞融合度達(dá)90%以上，呈平行旋渦狀排列(圖1A)，熒光顯微鏡下見細(xì)胞均勻散發(fā)綠色熒光(圖1B)；掃描電鏡下見外泌體直徑30～100 nm，呈杯狀雙層膜結(jié)構(gòu)(圖1C)；Western-blot檢測(cè)證實(shí)外泌體標(biāo)志蛋白CD9，CD81和CD63表達(dá)，且內(nèi)含有豐富的STAT3蛋白(圖1D)。

A：光鏡下大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)呈旋渦狀平行排列(×100)；B：熒光顯微鏡下MSCs均勻散發(fā)綠色熒光(×100)；C：掃描電鏡下外泌體形態(tài)呈杯狀雙層膜結(jié)構(gòu)；D：Western-blot檢測(cè)外泌體蛋白.圖1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞綠色熒光表達(dá)及其外泌體形態(tài)和蛋白表達(dá)Fig.1 Green fluorescence expression of rat bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) and MSCs-derived exosomes＇ morphology and protein expression

2.2大鼠骨髓MSCs外泌體對(duì)缺氧損傷RAEC增殖的影響 CCK-8法檢測(cè)RAEC增殖結(jié)果顯示(圖2)，24 h后，缺氧組的OD值(0.83±0.09)明顯低于對(duì)照組(1.20±0.24)(P<0.05)，與外泌體+缺氧組(0.94±0.10)比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.448)；48 h后，缺氧組的OD值進(jìn)一步下降，與對(duì)照組(1.82±0.21)比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而外泌體+缺氧組(1.32±0.14)明顯高于缺氧組(0.99±0.09)(P=0.001)；72 h后，對(duì)照組的OD值為(2.27±0.12)，明顯高于缺氧組和外泌體+缺氧組(P<0.001)，但外泌體+缺氧組(1.24±0.13)明顯高于缺氧組(0.82±0.11)(P<0.001)。

n=6. 與缺氧組和缺氧+外泌體組比較，△：P<0.001；與缺氧組比較，☆：P=0.001，#：P<0.001.圖2 3組間細(xì)胞增殖比較Fig.2 Comparison of cell proliferation among three groups

2.3大鼠骨髓MSCs外泌體對(duì)缺氧損傷RAEC黏附、遷移、內(nèi)皮管形成的影響 缺氧組姬姆薩染色黏附細(xì)胞數(shù)及結(jié)晶紫染色的遷移細(xì)胞數(shù)均明顯少于對(duì)照組，外泌體干預(yù)后兩種細(xì)胞數(shù)均明顯多于缺氧組(圖3A，3B)。同樣，外泌體+缺氧組內(nèi)皮管數(shù)量少于對(duì)照組，但明顯多于缺氧組(圖3C)。進(jìn)一步定量統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組黏附、遷移細(xì)胞數(shù)和內(nèi)皮管數(shù)分別為(553.0±28.1)，(740.0±17.4)和(13.2±1.5)個(gè)；缺氧無(wú)血清培養(yǎng)后，與對(duì)照組比較，細(xì)胞黏附、遷移和內(nèi)皮管形成能力明顯受損，黏附、遷移細(xì)胞數(shù)和內(nèi)皮管數(shù)分別為(114.0±15.6)，(202.7±19.8)和(2.5±0.6)個(gè)(均P<0.05)；而外泌體干預(yù)后，RAEC細(xì)胞功能明顯改善，黏附、遷移細(xì)胞數(shù)和內(nèi)皮管數(shù)分別為(224.7±21.5)，(387.7±22.1)和(9.3±0.6)個(gè)，與缺氧組比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05，圖4)。

A：姬姆薩染色檢測(cè)細(xì)胞黏附(×200)，外泌體+缺氧組(A3)陽(yáng)性細(xì)胞明顯多于缺氧組(A2)；B：結(jié)晶紫染色檢測(cè)細(xì)胞遷移(×400)，外泌體+缺氧組(B3)陽(yáng)性細(xì)胞明顯多于缺氧組(B2)；C：內(nèi)皮管形成實(shí)驗(yàn)(×100)，外泌體+缺氧組(C3)內(nèi)皮管明顯多于缺氧組(C2).圖3 3組細(xì)胞黏附、遷移和內(nèi)皮管形成Fig.3 Representive images of cell adhesion, migration and tube formation in three groups

n=3. A：200倍視野下各組黏附細(xì)胞比較；B：400倍視野下各組遷移細(xì)胞比較； C：100倍視野下各組內(nèi)皮管數(shù)量比較. 與對(duì)照組比較，☆：P<0.001；與缺氧組比較，△：P<0.001.圖4 光鏡下3組間細(xì)胞黏附、遷移和內(nèi)皮管形成比較Fig.4 Comparison of cell adhesion, migration and tube formation among three groups under light microscope

2.4大鼠骨髓MSCs外泌體對(duì)缺氧損傷RAEC的STAT3，VEGF，Ang-2和HIF-1蛋白表達(dá) 與對(duì)照組比較，缺氧誘導(dǎo)RAEC細(xì)胞VEGF，Ang-2和HIF-1蛋白表達(dá)上調(diào)(均P<0.05)；予外泌體干預(yù)后，VEGF，Ang-2和HIF-1蛋白表達(dá)進(jìn)一步增高；盡管缺氧組與對(duì)照組比較，STAT3蛋白表達(dá)無(wú)明顯差別，但缺氧刺激后p-STAT3表達(dá)明顯增強(qiáng)，而外泌體+缺氧組STAT3和p-STAT3的表達(dá)均明顯高于缺氧組和對(duì)照組(P<0.01，圖5)。

2.5大鼠骨髓MSCs外泌體對(duì)缺氧損傷RAEC的VEGF，Ang-2和HIF-1基因的mRNA表達(dá) 與對(duì)照組比較，缺氧組VEGF，Ang-2和HIF-1基因的mRNA表達(dá)均明顯升高(P<0.05)，且于外泌體干預(yù)后進(jìn)一步上調(diào)(P<0.05，圖6)。

2.6外泌體與STAT3蛋白共表達(dá) 對(duì)照組和缺氧組未見GFP表達(dá)，STAT3表達(dá)呈弱陽(yáng)性，外泌體+缺氧組RAEC可見GFP表達(dá)，STAT3表達(dá)(紅色熒光)明顯強(qiáng)于對(duì)照組和缺氧組，并且GFP定位與STAT3蛋白一致(圖7)。

n=3. VEGF：血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子；Ang-2：血管生成素2；HIF-1：缺氧誘導(dǎo)因子1；STAT3：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3；p-STAT3：磷酸化STAT3蛋白. A～E分別展示了VEGF，Ang-2，HIF-1，STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)水平；F：各個(gè)基因代表性蛋白電泳圖. 與對(duì)照組比較，☆：P<0.05，☆☆：P<0.05；與缺氧組比較，#：P<0.05，##：P<0.01.圖5 3組間VEGF，Ang-2，HIF-1，STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)比較Fig.5 Comparison of VEGF, Ang-2, HIF-1, STAT3 and phosphorylated STAT3 protein expression among three groups

n=3. VEGF：血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子；Ang-2：血管生成素2；HIF-1：缺氧誘導(dǎo)因子1. 與對(duì)照組比較，☆：P<0.05；與缺氧組比較，#：P<0.05.圖6 3組間VEGF，Ang-2和HIF-1基因的mRNA表達(dá)比較Fig.6 Comparison of VEGF, Ang-2 and HIF-1 mRNA expression among three groups

3 討 論

血管內(nèi)皮損傷是眾多缺血性疾病發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)及核心環(huán)節(jié)，如何有效減輕血管內(nèi)皮損傷已成為此類疾病防治的研究熱點(diǎn)之一。本研究利用缺氧無(wú)血清誘導(dǎo)RAEC損傷模型，發(fā)現(xiàn)骨髓MSCs來(lái)源的外泌體能夠改善缺氧狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞功能并促進(jìn)成血管活性，可能與傳遞STAT3蛋白進(jìn)而上調(diào)VEGF，Ang-2和HIF-1基因的mRNA和蛋白表達(dá)有關(guān)。

眾所周知，血管內(nèi)皮細(xì)胞是位于血管表面的單層扁平細(xì)胞，調(diào)節(jié)血液和組織間物質(zhì)代謝，起著維持血管穩(wěn)態(tài)的作用。缺血缺氧作為血管內(nèi)皮損傷的主要因素之一，可通過損傷血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)、破壞血液-組織屏障，進(jìn)而導(dǎo)致缺血性疾病的發(fā)生發(fā)展。與眾多研究結(jié)果一致[6-8]，本研究發(fā)現(xiàn)，缺氧無(wú)血清培養(yǎng)能夠有效誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、黏附、遷移及成血管活性受損，這為后續(xù)干預(yù)研究提供了有力保障。

圖7 激光共聚焦掃描顯微鏡下綠色熒光蛋白和STAT3蛋白共表達(dá)Fig.7 Co-expression of GFP and STAT3 under laser confocal scanning microscope

雖然研究已證實(shí)骨髓MSCs可直接通過內(nèi)皮細(xì)胞定向分化和(或)旁分泌機(jī)制減輕血管內(nèi)皮損傷[9-10]，但缺血組織中移植細(xì)胞的低存活率及成瘤風(fēng)險(xiǎn)限制了其臨床應(yīng)用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，外泌體是MSCs等多種干細(xì)胞移植治療發(fā)揮生物學(xué)作用的關(guān)鍵效應(yīng)介質(zhì)，不僅體積足夠小、易于通過組織屏障,而且無(wú)干細(xì)胞移植治療的潛在成瘤性風(fēng)險(xiǎn)[11-12]。目前,已有研究發(fā)現(xiàn),干細(xì)胞外泌體不僅可改善缺血心臟的心功能，還能夠誘導(dǎo)缺血組織血管新生[13-14]，有望成為干細(xì)胞治療的有效替代工具。本研究通過電鏡和Western-blot技術(shù)證實(shí)成功獲取MSCs來(lái)源外泌體，并發(fā)現(xiàn)將MSCs外泌體添加至缺氧無(wú)血清培養(yǎng)的RAEC，能夠明顯改善細(xì)胞增殖、黏附、遷移能力和成血管活性。

盡管如此，但MSCs外泌體保護(hù)損傷內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)制至今仍未完全清楚。理論上，外泌體可通過傳遞蛋白、microRNA及DNA等介導(dǎo)細(xì)胞間信號(hào)交互，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。既往蛋白組學(xué)研究顯示，骨髓MSCs外泌體中含有STAT3蛋白，但其功能角色尚無(wú)定論[5]。本研究通過Western-blot印跡法證實(shí)，骨髓MSCs外泌體富含STAT3蛋白，且于外泌體干預(yù)后表達(dá)明顯增加，而且以p-STAT3為主。共聚焦掃描顯微鏡也發(fā)現(xiàn)，外泌體與STAT3共定位于缺氧損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，提示MSCs外泌體可傳遞STAT3至缺氧無(wú)血清培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞并發(fā)生磷酸化修飾。結(jié)合功能學(xué)研究結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)MSCs外泌體對(duì)缺氧無(wú)血清損傷內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用可能與傳遞STAT3蛋白有關(guān)。

此外，本研究還探討了STAT3蛋白對(duì)下游保護(hù)性基因的調(diào)控作用。既往研究已明確，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能穩(wěn)態(tài)涉及眾多細(xì)胞因子或基因[15]。體外研究發(fā)現(xiàn)，添加外源性VEGF可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞存活，改善內(nèi)皮細(xì)胞增殖、黏附、細(xì)胞遷移，促進(jìn)血管新生[16]。而HIF-1可促進(jìn)VEGF和Ang-2等基因的轉(zhuǎn)錄激活，在缺氧條件下，HIF-1過表達(dá)能夠明顯增加血管內(nèi)皮細(xì)胞Ang-2和VEGF表達(dá)，促進(jìn)血管生成[17]。雖然當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受到缺血缺氧損傷后，也通過上調(diào)VEGF，Ang-2和HIF-1發(fā)揮內(nèi)源性保護(hù)作用，但低水平上調(diào)并不足以對(duì)抗缺血缺氧損傷。本研究結(jié)果顯示，缺氧組VEGF，Ang-2和HIF-1的蛋白和mRNA表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，但其細(xì)胞功能(如增殖、黏附、遷移和成血管活性)仍比對(duì)照組差。既往血管生成和神經(jīng)再生等領(lǐng)域的研究發(fā)現(xiàn)，VEGF，Ang-2和HIF-1作為STAT3的下游靶基因，STAT3蛋白經(jīng)磷酸化修飾后可上調(diào)VEGF，Ang-2和HIF-1[4，18-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，MSCs外泌體干預(yù)后的RAEC，p-STAT3表達(dá)明顯增高，同時(shí)伴隨VEGF,Ang-2和HIF-1表達(dá)上調(diào)，提示MSCs外泌體的內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制可能與傳遞STAT3至內(nèi)皮細(xì)胞并發(fā)生磷酸化后激活VEGF，Ang-2和HIF-1表達(dá)有關(guān)。

本研究存在一定局限性：如未進(jìn)行外泌體量效研究，且研究中未使用STAT3抑制劑或RNA干擾進(jìn)行反向驗(yàn)證。但研究結(jié)果表明，骨髓MSCs外泌體可以減輕缺氧無(wú)血清誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，并探討了STAT3蛋白在外泌體介導(dǎo)的內(nèi)皮保護(hù)作用中的功能角色，這不僅為將來(lái)缺血性疾病的防治提供了新的靶點(diǎn)，也有助于拓展臨床醫(yī)師對(duì)外泌體細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制的理解。