固相萃取—高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜測定水中5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素

摘 要：建立固相萃?。⊿PE）、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）同時測定水中5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素（羅紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素、螺旋霉素和泰樂菌素）的分析方法。水樣中的抗生素通過Oasis HLB固相萃取小柱富集后，以C18反相色譜柱為分析柱，甲醇和0.1%甲酸水溶液為流動相，采用HPLC-MS/MS進(jìn)行定量分析，檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），內(nèi)標(biāo)法定量。5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的回收率在64.8%～90.8%之間，儀器檢出限為0.012～0.085 μg/L，定量限為0.041～0.285 μg/L。將建立的方法用于檢測某化學(xué)工業(yè)園區(qū)周邊地表水中5種目標(biāo)分析物的殘留，均未檢測到泰樂菌素，其余4種抗生素均有不同程度檢出，檢出濃度在ng/L水平。

關(guān)鍵詞：大環(huán)內(nèi)酯類抗生素；固相萃??；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；水體

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1674-5124（2017）03-0058-05

Abstract： A method with solid phase extraction（SPE） and high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS） was developed for the determination of five macrolides （roxithromycin， clarithromycin， azithromycin， spiramycin and tylosin） in natural water samples. The macrolides were extracted from water samples using Oasis HLB cartridges and then separated on a reverse phase column using methanol and 0.1% formic acid as mobile phases. The macrolides were quantified with the internal standard method under multiple reaction monitoring（MRM） mode. The recoveries of the five macrolides ranged from 64.8% to 90.8%. The instrumental limits of detection and quantification are 0.012-0.085 μg/L and 0.041-0.285 μg/L respectively. Only Tylosin was not found by the proposed method in the studied rivers surrounding a Chemical Industry Park， while the other four macrolides were detected at the ng/L level.

Keywords： macrolides antibiotics（MLs）； solid phase extraction（SPE）； high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）； water

0 引 言

抗生素作為當(dāng)今重要的一類藥物，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)以及牲畜、水產(chǎn)養(yǎng)殖中。依據(jù)其不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)，抗生素主要分為喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類、氯霉素類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、頭孢菌素類、四環(huán)素類、氨基糖苷類[1]。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素（macrolides antibiotics，MLs）對治療因支原體、衣原體、流感嗜血桿菌以及立克次體等引起的疾病都特別有效，不僅能用于對人類的治療，也可以應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)[2]?？股乜赏ㄟ^不同的途徑進(jìn)入水環(huán)境中[3]，水體環(huán)境是抗生素最重要的一個匯。

鑒于抗生素對水生態(tài)系統(tǒng)和人體健康的潛在危害性，非常有必要對水環(huán)境中廣泛存在的這一類物質(zhì)進(jìn)行檢測。水環(huán)境中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素濃度相對較低，建立快速、科學(xué)、高效的預(yù)處理方法是前提[4]。對于水環(huán)境樣品，預(yù)處理方法包括液液萃取法、固相萃取法、固相微萃取方法等，其中固相萃取法最常用。目前大部分研究都是檢測分析水中多類抗生素[5-6]，單獨(dú)檢測大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的研究不多[7]，這些研究[8-11]預(yù)處理所用的固相萃取小柱大部分為Oasis HLB柱，儀器分析方法均采用高效液相色譜-質(zhì)譜特別是串聯(lián)質(zhì)譜；但由于檢測物質(zhì)為不同品種的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，樣品預(yù)處理條件、儀器工作參數(shù)有所不同。

本文在總結(jié)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，著重對分析方法進(jìn)行了篩選和優(yōu)化，建立了固相萃取（SPE）、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）同時測定水中羅紅霉素（roxithromycin，ROX）、克拉霉素（clarithromycin，CLAR）、阿奇霉素（azithromycin，AZI）、螺旋霉素（spir-amycin，SPM）和泰樂菌素（tylosin，TLS）5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素（其結(jié)構(gòu)如圖1所示）的分析方法，并應(yīng)用于實際地表水中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留的檢測。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

Agilent1260/API4000高效液相色譜儀/串聯(lián)質(zhì)譜（Agilent，ABI/SCIEX）；12管固相萃取裝置（Supelco）；500 mg/6 mL HLB固相萃取小柱（Waters）；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵（南京科爾儀器有限公司）；1 L玻璃砂芯過濾裝置（天津市津騰有限公司）；0.45 μm混纖膜（上海新亞凈化器件廠）；0.45 μm PTFE濾頭（天津市津騰實驗設(shè)備有限公司）。

甲醇（HPLC級，Merck）；甲酸（HPLC級，ROE Scientific）；超純水（MILLI-QAIO，Millipore）；羅紅霉素（純度97%，下同）、泰樂菌素（98.9%）、螺旋霉素（96%）購自Dr.Ehrenstorfer公司；克拉霉素（98%）、阿奇霉素（98%）購自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；采用西瑪通（Simatone）為內(nèi)標(biāo)物（100 μg/mL，AccuStandard）。

分別稱取5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品適量溶于甲醇中，配制成各抗生素儲備液，-20 ℃保存。取各抗生素儲備液適量溶于10 mL容量瓶中，加入甲醇定容，配制成100 mg/L的羅紅霉素、螺旋霉素、阿奇霉素、克拉霉素和200 mg/L的泰樂菌素的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素混合溶液，-20 ℃保存，使用時用甲醇稀釋至所需濃度。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

1 L水樣經(jīng)0.45 μm濾膜過濾以除去懸浮物，后轉(zhuǎn)移至干凈瓶子中，調(diào)節(jié)水樣pH至6～7。水樣以10 mL/min的流量通過Oasis HLB柱子（6 mL，500 mg），HLB柱使用前需進(jìn)行活化處理，預(yù)先用10 mL的甲醇分兩次淋洗，然后再使用10 mL的超純水淋洗。水樣過完柱后，加入5 mL超純水淋洗柱子以去除雜質(zhì)，負(fù)壓下抽15 min以去除水分。最后用15 mL甲醇分3次洗脫，收集洗脫液于50 mL氮吹瓶中。洗脫液在40 ℃的水浴條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1 mL以下，加入1 mL甲醇以淋洗氮吹瓶內(nèi)壁，后在40 ℃的水浴下用微弱的氮?dú)饬鳚饪s至0.5 mL以下，加入20 μL 200 μg/L的內(nèi)標(biāo)物溶液，溶液最后用甲醇定容至1 mL，經(jīng)0.45 μm PTFE濾頭過濾后轉(zhuǎn)移至2 mL棕色進(jìn)樣小瓶中，-20 ℃保存待儀器分析。

1.2.2 儀器工作參數(shù)

色譜條件：Waters Xterra C18液相色譜柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm），流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：甲醇。流量350 μL/min，進(jìn)樣量5 μL，柱溫35 ℃。梯度洗脫程序：0～0.5 min，保持5%B；0.5～1.5 min，5%B～30%B； 1.5～11.5 min，30%B～70%B；11.5～12 min，70%B～100%B；12～12.5 min，保持100%B，12.5～13 min，100%B～5%B；13～18 min，保持5%B。樣品需過0.45 μm的PTFE濾頭方可進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧正電離源（ESI+）；離子源I（ion source gas 1，GS1）和II（ion source gas 2，GS2）的氣體流量均為55 mL/min；碰撞氣（collision gas，CAD）和氣簾氣（curtain gas，CUR）流量分別為7 mL/min和25 mL/min，氣體均為N2；電離電壓（ion spray voltage，IS）為4 500 V；輔助加熱氣溫度（TEM）為450 ℃。檢測方式為多反應(yīng)選擇監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）離子模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜特征

優(yōu)化后的去簇電壓（decluster potential，DP）、碰撞能（collision energy，CE）及各抗生素的母離子和子離子等其他相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)見表1。結(jié)果表明，5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)物均能實現(xiàn)較好的分離，目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)物的MRM色譜圖見圖2。

2.2 線性范圍和檢出限

采用內(nèi)標(biāo)法定量，用以消除進(jìn)樣體積和儀器信號下降帶來的誤差。儀器的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別是儀器信噪比S/N=3和S/N=10時所對應(yīng)的質(zhì)量濃度。5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的線性方程、儀器檢出限和定量限見表2。結(jié)果表明，在0.5～500 μg/L范圍（泰樂菌素為1～1 000 μg/L）內(nèi)，5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素對應(yīng)的線性方程的線性相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，儀器檢出限為0.012～0.085 μg/L，定量限為0.041～0.285 μg/L。

2.3 加標(biāo)回收率實驗

采用超純水加標(biāo)，分別于1 L超純水中加入低、中、高3個水平的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素標(biāo)準(zhǔn)物，配制成除泰樂菌素的質(zhì)量濃度為10，40，200 ng/L，其他4種抗生素的質(zhì)量濃度為5，20，100 ng/L加標(biāo)溶液，測定方法的加標(biāo)回收率，加標(biāo)樣品的處理方法和實際樣品的處理方法相同，每個樣品平行測定3次。水樣加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）的結(jié)果見表3。結(jié)果表明，5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的加標(biāo)回收率在64.8%～90.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于12%。

2.4 實際樣品檢測

采用建立的分析方法檢測分析了實際地表水中的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留，地表水水樣的采集地點(diǎn)為南京化工園區(qū)附近的幾條河流，包括滁河、馬汊河、岳子河和皇廠河。由表4可見，在南京化工園區(qū)附近4條河流中，5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素中除泰樂菌素外均有不同程度檢出。從濃度范圍和分布范圍來看，克拉霉素只在滁河的1個采樣點(diǎn)中檢出，檢出頻率最低，但檢出濃度達(dá)25 ng/L以上，這可能是由于突發(fā)事件造成的，羅紅霉素檢出頻率最高，檢出質(zhì)量濃度在1.92～35.2 ng/L，阿奇霉素在各個點(diǎn)位上質(zhì)量濃度差異最大，檢測到的最小值為0.01 ng/L，而最大值為106 ng/L。

徐維海等[12]測得珠江廣州河段春季枯水期和夏季豐水期表層水中的羅紅霉素平均含量分別為32，18 ng/L；陸克祥等[13]在黃浦江水樣品中測得大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的質(zhì)量濃度為53.8～84.8 ng/L；Zhang等[14-15]在萊州灣水體中測得羅紅霉素的質(zhì)量濃度為ND～227 ng/L，阿奇霉素的質(zhì)量濃度為ND～88 ng/L，克拉霉素的質(zhì)量濃度為ND～32.9 ng/L，在黃河和渤海灣水體中測得的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素濃度均較低，其中克拉霉素測得質(zhì)量濃度最高，為8.1 ng/L。本文實際地表水樣品中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的檢出濃度均在ng/L級別，與國內(nèi)其他地表水檢出的濃度相當(dāng)。

3 結(jié)束語

本文建立了采用HLB柱進(jìn)行富集萃取、HPLC-MS/MS同時測定水中5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的分析方法，在0.5～500 μg/L質(zhì)量濃度范圍（泰樂菌素為1～1 000 μg/L）內(nèi)，5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素對應(yīng)的線性方程的線性相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，且其加標(biāo)回收率在64.8%～90.8%之間，儀器檢出限為0.012～0.085 μg/L，定量限為0.041～0.285 μg/L。

采用建立的分析方法，對實際地表水進(jìn)行了檢測分析，均未檢出泰樂菌素，其余4種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的檢出濃度均在ng/L級別，與國內(nèi)其他地表水檢出的濃度相當(dāng)。

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（編輯：莫婕）