花椒籽黑色素化學(xué)結(jié)構(gòu)的初步研究

摘 要：通過(guò)紫外光譜、高效液相色譜、紅外光譜、氣相色譜-質(zhì)譜等表征手段對(duì)花椒籽黑色素結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。采用堿提酸沉、萃取方法提取、分離純化花椒籽黑色素，用過(guò)氧化氫和聯(lián)二亞硫酸鈉對(duì)黑色素堿溶降解，分析其降解產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黑色素含有苯環(huán)、烷烴C-H、羥基、羧基、氨基等官能團(tuán)，是一種復(fù)雜大分子結(jié)構(gòu)，其降解產(chǎn)物含有N-乙基異丙胺、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚和丙氨酸丁氨酸硫醚。結(jié)果表明：花椒籽黑色素沒有植物性黑色素的兒茶酚結(jié)構(gòu)，是一種新的大分子黑色素，大紅袍和白沙椒的花椒籽黑色素為同一物質(zhì)。

關(guān)鍵詞：黑色素；花椒籽；結(jié)構(gòu)分析；GC-MS

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-5124（2017）03-0049-04

Abstract： The structural characteristics of Chinese prickly ash melanin are studied with UV spectra， HPLC， IR spectra and GC-MS. Melanin is obtained through alkali extraction and acid deposition， extraction and separation and purification. The Melanin is dissolved by alkali and degraded with H2O2 and Na2S2O4 and the degraded product is analyzed. The result shows Chinese prickly ash Melanin contains benzene ring， alkane C-H， hydroxyl， carboxyl and amino functional groups. It is a complex macromolecule and its degraded products contain 2-propanamine， 2，6-Di-tert-butyl-4-methylphenol and cystathionine. Results show that Chinese prickly ash Melanin has no catechol structure of plant Melanin and it is a new macromolecular Melanin. The Chinese prickly ash Melanin of Dahongpao and Baishajiao are the same substance.

Keywords： melanin； chinese prickly ash； structure analysis； GC-MS

0 引 言

黑色素廣泛分布于動(dòng)植物中，是酚類物質(zhì)的氧化和聚合過(guò)程中產(chǎn)生的一類黑色和棕色高分子化合物的統(tǒng)稱。它是生物體用來(lái)保護(hù)自身抵抗紫外線和電離輻射的一道屏障，在人體中亦參與許多生理、病理活動(dòng)，是決定人類皮膚、眼睛和頭發(fā)顏色的重要因素，同時(shí)一些疾病如：雀斑、黑斑、老年斑、黑色素細(xì)胞瘤、白發(fā)病、白癜風(fēng)等疾病與黑色素在人體中含量水平有關(guān)[1]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，天然黑色素能作為紫外線吸收劑、抗氧化劑和新型天然藥物載體，用以治療某些與黑色素缺乏有關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有抗癌、抑制艾滋病毒復(fù)制、抗蛇毒、治療帕金森癥等功能。同時(shí)，黑色食品如黑芝麻、黑米、黑豆等具有磁補(bǔ)、養(yǎng)生、抗衰老等方面的功效[2]，因此，黑色素在化妝品、食品、醫(yī)藥、裝飾等領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用前景。

黑色素是已知生物色素中最多最廣的一類色素，也是最為復(fù)雜的一類聚合物。自然界中黑色素分為3類：真黑素（eumelanins）、棕黑素（phaeomelanins）和異黑素（allomelanins）。真黑素呈黑色或褐色，含氮原子，是酪氨酸、二羥基苯丙氨酸、多巴胺和β-氨基乙基苯酚氧化聚合而產(chǎn)生。棕黑素顏色較真黑素淺，合成途徑與真黑素相同，不同在于胱氨酸或谷胱甘肽參加了合成過(guò)程。異黑素廣泛存在于植物體中，是酚類物質(zhì)在多酚氧化聚合酶作用下氧化聚合形成，其結(jié)構(gòu)類型至今仍不明確[3]。

近年來(lái)，人們對(duì)黑色食品中的黑色素進(jìn)行了一些研究，但從黑大米和黑大豆中提取的色素均為紅色素，在531 nm處有明顯的吸收峰[4]。本實(shí)驗(yàn)從花椒籽中成功提取黑色素，它在可見光區(qū)無(wú)明顯的吸收峰，可以說(shuō)是真正的黑色素。對(duì)于花椒籽黑色素分子結(jié)構(gòu)的研究，文獻(xiàn)中未見有報(bào)道，本文以堿性水溶液為溶劑，提取花椒籽黑色素。為了分析花椒籽黑色素結(jié)構(gòu)，用紫外光譜（UV）、高效液相色譜（HPLC）、紅外光譜（IR）、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）等方法進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

材料：花椒籽（品種：大紅袍，購(gòu)于陜西韓城；白沙椒，購(gòu)于河北滄州）；無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、石油醚、乙酸乙酯、聯(lián)二亞硫酸鈉、冰乙酸為分析純，N，O-雙-（三甲基硅烷基）三氟酰胺（Merck）、乙腈、甲醇為色譜純。

儀器：UV2550型紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；1890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；IRPrestge傅里葉變換紅外光譜儀（島津制作所）；高效液相色譜Agilent1260，四元梯度泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，色譜柱：SB-C18（150 m×4.6 mm，5 μm），VWD檢測(cè)器；高壓消解罐。

1.2 原料預(yù)處理

挑選兩個(gè)品種的花椒籽，用水洗干凈，除去表面的雜質(zhì)。80 ℃恒溫干燥以后，稱取一定量的花椒籽，用石油醚浸泡24 h，過(guò)濾備用。

1.3 黑色素的提取與純化

使用0.75 mol/L氫氧化鈉溶液在60 ℃下浸泡花椒籽40 min過(guò)濾，上清液中加HCl調(diào)節(jié)pH為1～2，使黑色素沉降并靜置。使用定量濾紙抽濾，沉淀用蒸餾水洗滌3次以去除氯離子和雜質(zhì)，依次用乙酸乙酯、氯仿、無(wú)水乙醇萃取去除雜質(zhì)，最后得到沉淀再用蒸餾水洗滌3次，80 ℃烘干至其質(zhì)量不再變化為止，得到的黑色固體即為干燥純化的黑色素。

1.4 UV吸收曲線測(cè)定

取兩個(gè)品種花椒籽的黑色素各0.035 5 g，氫氧化鈉0.64 g，用蒸餾水定容至100 mL的容量瓶中。以氫氧化鈉溶液為參比，用紫外可見分光光度計(jì)在200～800 nm做全掃描，測(cè)定吸收曲線。

1.5 HPLC測(cè)定黑色素

測(cè)定條件：流動(dòng)相：V（甲醇）∶V（乙腈）∶V（乙二胺）=40∶60∶0.5，流速1 mL/min，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)219 nm，進(jìn)樣量6 μL，測(cè)定兩個(gè)品種的花椒籽黑色素純化后的成分。

1.6 紅外光譜測(cè)定

用溴化鉀壓片兒法測(cè)定兩品種的黑色素。掃描范圍為40～4 000 nm，探究黑色素結(jié)構(gòu)中主要的功能性基團(tuán)。

1.7 GC-MS測(cè)定黑色素降解后產(chǎn)物

1.7.1 樣品的降解處理

堿熔降解：根據(jù)文獻(xiàn)取兩種花椒籽黑色素純品各50 mg，分別加入氫氧化鈉粉末500 mg，聯(lián)二亞硫酸鈉50 mg置于坩堝中，加入蒸餾水使之混勻，NaNO3鹽浴加熱20 min，放置一段時(shí)間冷卻，用冰乙酸酸化后過(guò)濾，用20 mL的無(wú)水乙醚萃取5次，合并萃取液并濃縮，用10 mL蒸餾水萃取3次以后，乙醚部分揮干溶劑，殘?jiān)靡译嫒芎髠溆谩?/p>

雙氧水降解：取黑色素溶液，加入雙氧水10 mL，在水浴中反應(yīng)10 min，冷卻。用100 mL乙醚萃取5次，用水洗3次，合并萃取液，減壓抽濾至乙醚揮發(fā)干凈，殘?jiān)靡译嫒芙鈧溆谩?/p>

1.7.2 樣品降解產(chǎn)物的硅烷化

取0.5 mL上一步反應(yīng)所得的樣品降解產(chǎn)物，加0.5 mL N，O-雙-（三甲基硅烷基）三氟酰胺，密封，在125 ℃的條件下反應(yīng)30 min[5]，取樣做GC-MS分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 UV掃描結(jié)果

UV掃描結(jié)果見圖1，提取液的紫外掃描曲線與文獻(xiàn)[6]報(bào)道的一致，在可見光區(qū)無(wú)明顯吸收，在紫外區(qū)有一定吸收，其最大吸收波長(zhǎng)為219 nm，說(shuō)明提取得到的為花椒籽中的黑色素，兩個(gè)品種花椒籽掃描結(jié)果相同。

2.2 HPLC測(cè)定結(jié)果

高效液相色譜圖見圖2?？梢钥闯?，在2.256 min時(shí)，有一個(gè)較強(qiáng)的峰即黑色素。通過(guò)純化后，黑色素只有單一組分以及另外一種微量雜質(zhì)，在3.584 min處的雜質(zhì)，峰值較小，雜質(zhì)含量低，對(duì)后續(xù)測(cè)定結(jié)果影響不大。兩種黑色素峰形一致。

2.3 紅外光譜掃描結(jié)果

紅外光譜能夠表征花椒籽中黑色素的主要官能團(tuán)。由圖3可知，花椒籽黑色素基團(tuán)的特征吸收峰主要集中在3 300～3 500，2 500～3 000，450～1 800 cm-1 3組峰上。在3 414 cm-1處有O-H伸縮振動(dòng)的強(qiáng)吸收峰，說(shuō)明花椒籽黑色素中有-OH存在。一般固體及液體的羧酸均以締合狀態(tài)存在，所以在2 500～3 000 cm-1處有吸收峰。3 000～3 500 cm-1處有吸收峰，是由N-H伸縮振動(dòng)產(chǎn)生，說(shuō)明有-NH2或-NH（締合）。在1 600～1 800 cm-1有羰基伸縮振動(dòng)吸收峰，與3 400 cm-1的強(qiáng)吸收峰在一起，指示-COOH結(jié)構(gòu)的存在。在1 600 cm-1附近有芳環(huán)骨架振動(dòng)引起的較強(qiáng)的吸收峰，所以含苯環(huán)結(jié)構(gòu)。在650～860 cm-1范圍內(nèi)吸收帶很弱，2 000 cm-1附近有比較弱的苯環(huán)上氫吸收峰，表明芳環(huán)被取代，形成共軛體系。在2 830～2 930 cm-1存在相對(duì)較弱的烷烴結(jié)構(gòu)的C-H吸收峰?；ń纷押谏氐募t外掃描結(jié)果與文獻(xiàn)中報(bào)道的黑芝麻色素的紅外掃描結(jié)果不一致[7]，證明兩種黑色素外觀雖然相似，但是結(jié)構(gòu)仍有不同，不是同一種物質(zhì)，但兩種花椒籽黑色素紅外掃描結(jié)果一致。

2.4 氣相色譜質(zhì)譜結(jié)果分析

2.4.1 堿熔降解樣品的GC-MS結(jié)果

堿熔降解黑色素的GC-MS結(jié)果見圖4。在10.432 min處峰為十六甲基環(huán)辛硅氧烷，是硅烷化試劑自身轉(zhuǎn)化而成，按照文獻(xiàn)報(bào)道的處理方法[8]，不能得到花椒籽降解產(chǎn)物，該方法不能作為確定花椒籽黑色素的檢測(cè)方法。

2.4.2 雙氧水降解樣品的GC-MS結(jié)果

雙氧水降解產(chǎn)物GC-MS結(jié)果見圖5，分析檢索物質(zhì)種類見表1。樣品處理后得到3種主要降解產(chǎn)物：N-乙基異丙胺，2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚和丙氨酸丁氨酸硫醚（又名胱硫醚）；其余為硅烷化試劑的降解產(chǎn)物。結(jié)合紅外檢測(cè)到含有-NH（締合），說(shuō)明N-乙基異丙胺是黑色素結(jié)構(gòu)的一部分。2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的存在與紅外檢測(cè)含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)是一致的，說(shuō)明2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚是黑色素結(jié)構(gòu)的一部分。2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚又名抗氧化劑264，是一種能夠抑制或延緩氧化的抗氧化劑、穩(wěn)定劑，這也驗(yàn)證了文獻(xiàn)中提及的黑色素具有抗氧化能力。胱硫醚是半胱氨酸和胱氨酸的結(jié)合物，是含硫氨基酸的代謝中間體，這與紅外檢測(cè)含有羰基和-NH2一致。同時(shí)胱硫醚中羧基和2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚中酚羥基的存在也在一定程度上解釋了黑色素為什么可溶于堿性溶液中。大紅袍和白沙椒兩種花椒籽黑色素，降解產(chǎn)物相同。

3 結(jié)束語(yǔ)

Nicolaus等提出動(dòng)物源黑色素屬于吲哚型，而植物源黑色素屬于鄰苯二酚型。Prota等經(jīng)過(guò)進(jìn)一步研究，根據(jù)其結(jié)構(gòu)單元以吲哚還是苯并噻嗪為骨架，將動(dòng)物源黑色素分為Eumelanin和Pheomelanin，并推測(cè)其結(jié)構(gòu)單元如圖6所示。

通過(guò)對(duì)樣品紫外光譜、紅外光譜、GC-MS解析表明，花椒籽黑色素是含有芳環(huán)、羧基、氨基等官能團(tuán)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。其降解產(chǎn)物中胱硫醚的存在，一定程度上說(shuō)明了花椒籽黑色素具有噻嗪骨架結(jié)構(gòu)，是Pheomelanin結(jié)構(gòu)。這不同于文獻(xiàn)中報(bào)到的含有兒茶酚結(jié)構(gòu)的植物性黑色素，說(shuō)明該種黑色素結(jié)構(gòu)是一種新型結(jié)構(gòu)。

真黑素與棕黑素的主要區(qū)別在于其合成過(guò)程中是否有半胱氨酸的參與，并且半胱氨酸是唯一參與棕黑色素合成的硫化物。半胱氨酸與多巴醌反應(yīng)，經(jīng)過(guò)一系列過(guò)程，最終形成棕黑素[9]，如圖7所示。

花椒籽黑色素中半胱氨酸結(jié)構(gòu)的存才，證明花椒籽黑色素為棕黑素，是一種新型的黑色素結(jié)構(gòu)。大紅袍和白沙椒兩個(gè)品種的黑色素表征結(jié)果一致，說(shuō)明兩種花椒籽黑色素為同一種物質(zhì)。但關(guān)于花椒籽黑色素的具體結(jié)構(gòu)仍需要借助其他手段進(jìn)一步探討。

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（編輯：徐柳）