高效液相色譜法測(cè)定飲料中的呋喃-2，5-二甲酸

汪 輝，李 莎，夏立新，2，彭新凱，2，李晰暉，周 鵬

(1．長沙市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測(cè)中心，湖南 長沙 410013;2．湖南省食品安全生產(chǎn)工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410013)

呋喃-2，5-二甲酸(FDCA)為白色粉末狀固體，是重要的有機(jī)合成中間體，可用于制備各種烷基取代或酯類呋喃衍生物［1－2］，也可用于新型聚酯材料聚乙烯呋喃-2，5-二甲酸乙二醇酯(PEF)的合成［3］。在藥理學(xué)方面，呋喃-2，5-二甲酸的二乙基酯具有與可卡因類似的麻醉作用，2，5-呋喃二甲酸鈣鹽具有抑制巨大芽孢桿菌生長的功能［1］。

近年來，基于可再生資源的呋喃芳香性聚合物材料越來越受關(guān)注［3］。PEF瓶也已大規(guī)模生產(chǎn)并用于食品飲料行業(yè)［4－5］。2014年10月，歐盟食品安全局發(fā)表的《關(guān)于安全評(píng)價(jià)的科學(xué)意見:呋喃-2，5-二甲酸，CAS:3238－40－2，用于食品接觸材料》指出，當(dāng)呋喃-2，5-二甲酸作為生產(chǎn)聚乙烯呋喃酸酯聚合物(PEF)的單體時(shí)，物質(zhì)本身遷移到食品中的量若不超過5 mg/kg，則不會(huì)對(duì)人體構(gòu)成威脅［6］。因此，建立飲料中呋喃-2，5-二甲酸的測(cè)定方法，有利于及時(shí)掌握PEF瓶中呋喃-2，5-二甲酸向飲料中的遷移情況，同時(shí)也可為食品安全監(jiān)控提供有力的技術(shù)支撐。

目前，國內(nèi)外測(cè)定呋喃類物質(zhì)的方法有液相色譜(HPLC)法［7－8］和氣相色譜－質(zhì)譜(GC－MS)法［9－10］，主要用于測(cè)定呋喃醛、呋喃醇和呋喃一元酸，而關(guān)于呋喃二元酸的測(cè)定較少報(bào)道。陳天明［11］建立了紅外光譜法測(cè)定呋喃二元酸的分析方法，但僅適用于高含量呋喃-2，5-二甲酸，而不適用于食品中微量和痕量呋喃-2，5-二甲酸的分析［12］。本方法結(jié)合呋喃-2，5-二甲酸的化學(xué)性質(zhì)，采用高效液相色譜法測(cè)定其在飲料中的含量［13－14］，利用保留時(shí)間，結(jié)合紫外光譜定性，外標(biāo)法定量，結(jié)果令人滿意。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

1260型高效液相色譜儀，配在線脫氣機(jī)、四元泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器和二極管陣列檢測(cè)器(美國Agilent公司);SK－1型快速混勻器(江蘇金壇醫(yī)療儀器廠);A10型超純水處理器(美國Millipore公司)。

乙腈(色譜純，德國Merck公司);冰乙酸(色譜純，純度≥99.5%，天津市化學(xué)試劑研究所);乙酸銨(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取10 mg呋喃-2，5-二甲酸于100 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，配成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃冷藏保存。使用時(shí)，用水逐級(jí)稀釋成標(biāo)準(zhǔn)中間液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 HPLC儀器條件

色譜柱為Venusil HILIC(4.6 mm×250 mm，5 μm);柱溫為40℃;流速為1.0 mL/min;流動(dòng)相為0.02 mol/L乙酸銨(冰乙酸調(diào)至pH 3.5)－乙腈(50∶50)，等度洗脫;波長掃描范圍為190～400 nm，檢測(cè)波長為265 nm;進(jìn)樣量為10 μL。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取樣品9 g(精確至0.1 mg)，加水定容至10 mL，混勻后過0.45 μm微孔濾膜，濾液待測(cè)試用。

2 結(jié)果與討論

2.1 波長的選擇

配制5.0 mg/L呋喃-2，5-二甲酸溶液，不接色譜柱直接進(jìn)樣分析，采用二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，波長掃描范圍為190～400 nm。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，呋喃-2，5-二甲酸在265 nm處有最大吸收，故本實(shí)驗(yàn)選擇檢測(cè)波長為265 nm。

2.2 色譜柱的選擇

利用Ultimate AQ－C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)對(duì)呋喃-2，5-二甲酸進(jìn)行檢測(cè)，采用純水作為流動(dòng)相，但由于目標(biāo)化合物的極性較大，其保留值較小。進(jìn)一步考察了采用極性改性固定相的InspireTMHILIC(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱和采用中性的酰胺鍵合基團(tuán)的Venusil HILIC(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱對(duì)呋喃-2，5-二甲酸的測(cè)定情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前者較后者的保留能力弱，且目標(biāo)化合物在不同pH值流動(dòng)相(0.02 mol/L乙酸銨－乙腈)下均出現(xiàn)雙峰。故本實(shí)驗(yàn)選擇Venusil HILIC(4.6 mm×250 mm，5 μm)為最佳色譜柱。

2.3 流動(dòng)相的選擇

考察了不同比例的0.02 mol/L乙酸銨(pH 6.8)－乙腈(60∶40，50∶50，40∶60，30∶70，20∶80)作為流動(dòng)相時(shí)的測(cè)定情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)0.02 mol/L乙酸銨(pH 6.8)－乙腈比例為20∶80時(shí)，目標(biāo)化合物出現(xiàn)雙峰;比例為30∶70時(shí)，色譜峰前延;比例為60∶40，50∶50和40∶60時(shí)峰形對(duì)稱，但隨著乙腈比例的升高，目標(biāo)化合物的保留值增大，且響應(yīng)值降低，考慮到長時(shí)間高比例水相會(huì)影響色譜柱的壽命，因此最終選擇比例為50∶50的流動(dòng)相。另外，考察了0.02 mol/L乙酸銨－乙腈(50∶50)流動(dòng)相在不同pH值(pH 6.8，5.0，3.5)條件下對(duì)目標(biāo)化合物的測(cè)定情況(見圖1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)化合物的保留值隨著pH值的降低而升高;當(dāng)采用0.02 mol/L乙酸銨(pH 3.5)－乙腈(50∶50)作為流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)化合物的峰形對(duì)稱，保留值合適，分離度較高，因此實(shí)驗(yàn)選其作為流動(dòng)相。

圖1 呋喃-2，5-二甲酸在不同pH值流動(dòng)相下的色譜圖Fig.1 Chromatograms of furan-2，5-dicarboxylic acid in mobile phase system with different pH values

2.4 線性關(guān)系、靈敏度與儀器精密度

配制8個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按本方法進(jìn)行測(cè)定，以呋喃-2，5-二甲酸的質(zhì)量濃度(X，mg/L)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，呋喃-2，5-二甲酸在0.5～100 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=66.86X－5.780，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.999 9。采用空白混合樣品溶液稀釋低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，以信噪比S/N≥3確定方法的檢出限(LOD)為0.15 mg/kg，以S/N≥10確定方法的定量下限(LOQ)為0.5 mg/kg。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)溶液與加標(biāo)樣品溶液的色譜圖(5 mg/L)Fig.2 Chromatograms of standard solution and spiked sample solution(5 mg/L)

配制相同濃度的礦物質(zhì)水、可樂和鮮橙多加標(biāo)溶液，按照本方法分別重復(fù)進(jìn)樣6次進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算呋喃-2，5-二甲酸保留值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.61%，0.66%和0.18%，峰面積的RSD分別為0.57%，0.62%和0.98%，均符合定性(＜1.0%)與定量(＜3.0%)的重復(fù)性要求［15］，表明儀器具有良好的精密度。

2.5 回收率與精密度

采用空白樣品加標(biāo)法測(cè)定樣品中呋喃-2，5-二甲酸的回收率。在礦物質(zhì)水、可樂飲料和鮮橙多飲料空白樣品中分別添加LOQ，2LOQ和10LOQ濃度的目標(biāo)化合物，每個(gè)加標(biāo)水平進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)(見圖2)?？瞻讟悠分羞秽?2，5-二甲酸的回收率為93.2%～109.0%，RSD為0.9%～4.2%，結(jié)果見表1，符合實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制要求［16］。

表1 空白樣品中呋喃-2，5-二甲酸的加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 1 Recoveries and RSDs of furan-2，5-dicarboxylic acid spiked in blank samples(n=6)

2.6 穩(wěn)定性考察

取相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液以及礦物質(zhì)水、橙汁與可樂的加標(biāo)溶液，分別在0，2，4，8，12，24 h采用本方法進(jìn)行測(cè)定，記錄保留值和峰面積，計(jì)算得上述溶液的保留值RSD不超過0.6%，峰面積的RSD不超過1.0%，說明呋喃-2，5-二甲酸在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 干擾實(shí)驗(yàn)

飲料中一般含有機(jī)酸和食品添加劑，為考察這些化合物對(duì)呋喃-2，5-二甲酸測(cè)定的干擾情況，分別將有機(jī)酸(檸檬酸、蘋果酸和酒石酸)、防腐劑(山梨酸、苯甲酸和脫氫乙酸)、甜味劑(乙酰胺磺酸鉀和糖精鈉)和人工合成著色劑(亮藍(lán)、檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、赤蘚紅和誘惑紅)標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到呋喃-2，5-二甲酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液和加標(biāo)混合樣品溶液中，使其質(zhì)量濃度均為5 mg/L，采用本方法對(duì)上述溶液進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明:在優(yōu)化條件下，部分化合物在265 nm處無響應(yīng)，部分化合物雖有響應(yīng)，但與目標(biāo)化合物的保留時(shí)間不一致，可與目標(biāo)化合物達(dá)到基線分離(見圖3)。因此上述化合物對(duì)本方法測(cè)定呋喃-2，5-二甲酸幾乎無干擾［17］。

圖3 干擾實(shí)驗(yàn)中呋喃-2，5-二甲酸的色譜圖Fig.3 Chromatograms of furan-2，5-dicarboxylic acid in interference tests

2.8 實(shí)際樣品的測(cè)定

在優(yōu)化條件下，采用本方法測(cè)定了12份市售飲料(飲用水、果汁飲料和碳酸飲料)中呋喃-2，5-二甲酸的含量，采用保留時(shí)間和紫外光譜定性，輔以樣品加標(biāo)定性，外標(biāo)法定量。結(jié)果均未檢出呋喃-2，5-二甲酸(＜0.15 mg/kg)。

3 結(jié)論

本文建立了測(cè)定飲料中呋喃-2，5-二甲酸含量的高效液相色譜分析方法，采用親水色譜柱Venusil HILIC(4.6 mm×250 mm，5 μm)對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分析，二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定。該方法操作簡便，線性范圍寬，回收率高，完全能夠滿足飲料中呋喃-2，5-二甲酸的測(cè)定要求。

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