MEG3對人胰腺癌細胞SW1990侵襲及運動能力的影響

董偉華 陳瑞東 胡端敏 唐文

MEG3對人胰腺癌細胞SW1990侵襲及運動能力的影響

董偉華 陳瑞東 胡端敏 唐文

母系表達基因3(maternally expressed gene 3, MEG3)是小鼠母體印記基因Gt12的人類同系物，定位于染色體14q32.3，屬于長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)lncRNA是調(diào)控基因表達、染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后加工等過程的重要分子[2-3]，與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。MEG3在多種正常組織中表達，但在多種腫瘤細胞中表達缺失[4-7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，人胰腺癌SW1990細胞中MEG3基因表達缺失，而上調(diào)MEG3表達后能顯著抑制腫瘤細胞的增殖，并促進腫瘤細胞的凋亡[8]。本研究進一步觀察MEG3對SW1990細胞侵襲及運動能力的影響。

一、材料與方法

1．pcDNA3.0-MEG3質(zhì)粒的構(gòu)建及SW1990細胞轉(zhuǎn)染：質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染方法參考文獻[8]。實驗分為對照組、空質(zhì)粒組、MEG3質(zhì)粒組。對照組細胞僅加轉(zhuǎn)染試劑，空質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染pcDNA3.0質(zhì)粒，MEG3質(zhì)粒組轉(zhuǎn)染pcDNA 3.0-MEG3質(zhì)粒。

2．Transwell小室體外運動及侵襲實驗：Transwell小室用于運動實驗，Transwell小室間隔膜用Metrigel覆蓋凝固后用于侵襲實驗。取各組對數(shù)生長期細胞，用無血清的DMEM培養(yǎng)液將細胞密度調(diào)整到1×106/ml。Transwell上室加入細胞懸液200 μl，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液500 μl，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄Transwell上室液體，用棉簽小心擦去濾膜上方的細胞，取隔膜用甲醇固定15 min后用0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下選取5 個高倍視野，計數(shù)濾膜下方的穿膜細胞數(shù)。每組設(shè)3個小室，實驗重復(fù)3次。

3．SW1990細胞去甲基化處理：將5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-aza-CdR)溶于DMSO中配成50 mmol/L的溶液，以10、100 μmol/L的終濃度處理SW1990細胞72 h，以等容積DMSO溶液處理72 h的SW1990細胞作為對照組。

4．RT-PCR檢測MEG3 mRNA表達：收集上述各組細胞，提取總RNA，合成cDNA，行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳凝膠成像。

二、結(jié)果

1．各組SW1990細胞MEG3 mRNA表達：MEG3質(zhì)粒組SW1990細胞在近200 bp處有一MEG3特異性擴增條帶，而空質(zhì)粒組及對照組SW1990細胞未見擴增條帶。

2．Transwell小室體外運動實驗：對照組、空質(zhì)粒組、MEG3質(zhì)粒組的24 h穿膜細胞數(shù)分別為(88.0±4.58)、(86.0±3.61)、(87.3±1.53)個/200倍視野，各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1)。

3．Transwell小室體外侵襲實驗：對照組、空質(zhì)粒組、MEG3質(zhì)粒組的24 h穿膜細胞數(shù)分別為(75.0±2.65)、(73.7±4.16)、(72.3±3.21)個/200倍視野，各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1)。

4．去甲基化前后SW1990細胞MEG3 mRNA表達水平的變化：去甲基化試劑處理SW1990細胞后，MEG3 mRNA的表達水平較未處理對照組明顯上升(圖2)，間接證實MEG3基因的失活是由于其發(fā)生了超甲基化。

討論研究發(fā)現(xiàn)MEG3基因在人神經(jīng)纖維瘤、腦膜瘤、骨髓增生異常綜合征和急性粒白血病、非小細胞肺癌、胃癌、卵巢癌等腫瘤中表達下調(diào)或缺失[8-12]，進一步研究發(fā)現(xiàn)其原因是MEG3啟動子的異常甲基化。神經(jīng)纖維瘤、肝細胞癌、乳腺癌細胞、宮頸癌細胞、卵巢癌細胞經(jīng)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-CdR處理后MEG3基因重新表達[10,13]。本研究采用5-aza-CdR處理人胰腺癌SW1990細胞后，細胞MEG3 mRNA的表達水平明顯升高，也證實MEG3基因的失活是由于其啟動子發(fā)生了超甲基化。

圖1 對照組(A)、空質(zhì)粒組(B)、MEG3質(zhì)粒組(C)穿膜細胞(左：運動實驗；右：侵襲實驗)

圖2 對照組(1)，10、100 μmmol/L 5-aza-CdR處理組(2、3)，MEG3質(zhì)粒組(4)SW1990細胞MEG3 mRNA表達

胰腺癌是一種治療困難，預(yù)后極差的腫瘤類型，其原因與該腫瘤易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的過程，在這一過程中，細胞外基質(zhì)起天然屏障作用，腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)黏附，使之降解，并最終穿越屏障導(dǎo)致遠處轉(zhuǎn)移。腫瘤細胞間同質(zhì)性黏附的減弱有利于腫瘤細胞脫離母體瘤組織，而腫瘤細胞與內(nèi)皮細胞、層粘連蛋白、纖維連接蛋白及Ⅳ型膠原等之間異質(zhì)性黏附的增強則提高了腫瘤細胞的侵襲能力。Tian等[7]和Sun等[14]報道MEG3與骨肉瘤、乳腺癌的臨床分期及遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，MEG3對胰腺癌SW1990細胞的運動及侵襲能力并無影響，與Lu等[9]的結(jié)論相同。各研究得出結(jié)論的不一致是否與腫瘤細胞系的不同有關(guān)，目前尚不能定論。因此，要得到更準確的MEG3對腫瘤遷移與侵襲的影響，還需要在更多的細胞系中進行驗證。

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10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.06.015

江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃項目(SJLX-0564)

215000 江蘇蘇州，蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科

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2016-11-04)

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