急性胰腺炎患者尿液代謝組學(xué)分析

劉盛蘭 郭強(qiáng) 楊新靜 孫雪 趙大國(guó) 徐俊 陳衛(wèi)昌

急性胰腺炎患者尿液代謝組學(xué)分析

劉盛蘭 郭強(qiáng) 楊新靜 孫雪 趙大國(guó) 徐俊 陳衛(wèi)昌

目的檢測(cè)病情嚴(yán)重程度不同的急性胰腺炎(AP)患者尿液小分子代謝物譜，篩選對(duì)AP及其嚴(yán)重程度具有潛在診斷價(jià)值的差異代謝物。方法收集蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院65例AP患者，其中中、重癥AP(MSAP+SAP)29例，輕癥AP(MAP)36例，以25名健康志愿者作為對(duì)照組。采用液相色譜與質(zhì)譜(LC-MS)結(jié)合方法檢測(cè)AP患者及健康對(duì)照者尿液中小分子代謝物。采用多元統(tǒng)計(jì)分析，構(gòu)建主成分分析(PCA)及偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)模型并驗(yàn)證，篩選差異代謝物。結(jié)果PCA模型具有很好的可解釋度(R2X>0.5)，各組尿液樣本具有較好的區(qū)分聚類趨勢(shì)，獲得了較好的分類模型。各組間PLS-DA模型的對(duì)比使差異進(jìn)一步凸顯，各組樣本呈明顯的區(qū)分聚類，具有較高的可預(yù)測(cè)性(Q2>0.7)，PLS-DA置換檢驗(yàn)圖提示評(píng)估模型可靠有效。AP組與對(duì)照組對(duì)比，從尿液中篩選出17個(gè)差異代謝物，其中壬二酸、琥珀酸半醛、D-β-羥基丁酸、乙酰肉堿、當(dāng)歸酸、癸二酸、馬尿酸7個(gè)差異代謝物整合對(duì)AP的診斷敏感性為100%，特異性為94%。對(duì)照組、MAP組、MSAP+SAP組兩兩對(duì)比，尿液琥珀酸半醛、D-β-羥基丁酸、乙酰肉堿、蘋果酸、當(dāng)歸酸5個(gè)差異代謝物整合對(duì)SAP的診斷敏感性、特異性均為90%。結(jié)論LC-MS代謝組學(xué)技術(shù)可以有效地識(shí)別不同嚴(yán)重程度AP患者尿液代謝物的變化，篩選出的差異代謝物對(duì)AP的診斷及分級(jí)具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

胰腺炎； 代謝產(chǎn)物學(xué)； 液相色譜-質(zhì)譜法； 生物學(xué)標(biāo)記

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)之后興起的一個(gè)新的組學(xué)研究熱點(diǎn)，側(cè)重于關(guān)注相對(duì)分子量小于1 000的代謝產(chǎn)物，觀察生物體系在受到外界影響后其代謝產(chǎn)物譜的動(dòng)態(tài)變化[1-3]。代謝組學(xué)的分析方法以其高分離效率、高靈敏度及極低檢測(cè)限等優(yōu)勢(shì)成為尋找急性胰腺炎(AP)早期診斷、病情評(píng)估的新的生物學(xué)標(biāo)志物的潛在有力工具。本研究采用液相色譜與質(zhì)譜(liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS)方法檢測(cè)AP患者的尿液樣本，篩選其與健康者的差異代謝物，探討這些差異代謝物對(duì)AP診斷及嚴(yán)重程度評(píng)估的潛在臨床價(jià)值。

資料與方法

一、一般資料

選取2016年8月至2017年2月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科、急診科及消化內(nèi)科收治的AP患者，診斷符合2013年中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)胰腺疾病學(xué)組制定的標(biāo)準(zhǔn)[4]。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有心血管、腦血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等基礎(chǔ)疾病；(2)合并糖尿病、甲亢、甲減等代謝性疾??；(3)懷疑或確定有酒精、藥物濫用病史；(4)長(zhǎng)期服用某種藥物；(5)近兩周內(nèi)有重大生活事件；(6)哺乳期、妊娠期婦女。最終納入65例AP患者，其中男性34例，女性31例，平均年齡(50±17)歲。以同期25名健康志愿者作為對(duì)照組，其中男性10例，女性15例，平均年齡(45±13)歲。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及志愿者均簽署知情同意書。

因需要在疾病早期(<24 h)收集樣本以減少藥物等對(duì)樣品代謝的潛在影響，故將中度重癥急性胰腺炎(MSAP)及重癥急性胰腺炎(SAP)患者歸為MSAP+SAP組。本研究MSAP+SAP組29例，輕癥急性胰腺炎(MAP)組36例。

二、尿液代謝物L(fēng)C-MS分析

取AP患者入院次日晨中段尿2 ml，分裝到凍存管，用parafilm膜封好后置-80℃冰箱冷凍保存。健康志愿者在樣本收集前一天食用清淡飲食，避免海鮮以及辛辣食物，并禁止吸煙飲酒，以減少食物對(duì)代謝造成的波動(dòng)。

所有樣本在4℃下融化，每個(gè)樣本取100 μl于1.5 ml離心管，加100 μl ddH2O振蕩混勻5 min，10 000 g 4℃離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm膜過(guò)濾得到待測(cè)樣本。從每個(gè)待測(cè)樣本各取20 μl混合成質(zhì)控(quality control，QC)樣本，用來(lái)校正混合樣品分析結(jié)果的偏差以及由于分析儀器自身原因所造成的失誤。剩余待測(cè)樣本行LC-MS檢測(cè)。

色譜儀為Waters ACQUITY UPLC，使用ACQUITY UPLC?HSS T3 1.8 μm(2.1 mm×150 mm)色譜柱。自動(dòng)進(jìn)樣器溫度設(shè)為4℃，流速0.25 ml/min，柱溫40℃，進(jìn)樣3 μl后行梯度洗脫，流動(dòng)相為0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B)。梯度洗脫程序：2% B洗脫0～1 min，2%～50% B洗脫1～9.5 min，50%～98% B洗脫9.5～14 min，98% B洗脫14～15 min，98%～2% B 洗脫15～15.5 min，2%B洗脫15.5～17 min[5]。

質(zhì)譜儀為Thermo LTQ Orbitrap XL，電噴霧離子源(ESI)，采用正、負(fù)離子電離模式，正離子噴霧電壓為4.80 kV，負(fù)離子噴霧電壓為4.50 kV，鞘氣40 arb，輔助氣15 arb。毛細(xì)管溫度325℃，毛細(xì)管電壓35 V/-15 V，管透鏡電壓50 V/-50 V，以分辨率60 000進(jìn)行全掃描，掃描范圍50～1 000質(zhì)核比(m/z)，并采用CID(碰撞誘導(dǎo)解離)進(jìn)行二級(jí)裂解，碰撞電壓為30 eV，同時(shí)采用動(dòng)態(tài)排除法(重復(fù)計(jì)數(shù)為2)去除無(wú)用的MS/MS(二級(jí)質(zhì)譜)信息，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)置為15 s[6]。

通過(guò)Proteowizard軟件(v3.0.8789)將獲得的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成mzXML 格式[7]，利用R(v3.1.3)的XCMS程序包進(jìn)行峰識(shí)別、峰過(guò)濾、 峰對(duì)齊，得到包括質(zhì)核比、保留時(shí)間及峰面積等信息的數(shù)據(jù)矩陣；分別在正、負(fù)離子模式下獲得前體分子，導(dǎo)出數(shù)據(jù)至excel進(jìn)行后續(xù)分析。為使不同量級(jí)的數(shù)據(jù)能夠進(jìn)行比較，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行峰面積的批次歸一化。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件SIMCA-P 13.0(Umetrics，Umea，瑞典)進(jìn)行主成分(principal component analysis, PCA)、偏最小二乘-判別(partial least squares-discriminant analysis, PLS-DA)分析，采用PLS-DA第一主成分VIP(variable importance )值>1結(jié)合Mann-Whitney-Wilcoxon Test檢驗(yàn)P值<0.05篩選差異代謝物。差異代謝物的鑒定首先根據(jù)精確分子量進(jìn)行初步確認(rèn)(分子量誤差為<10 ppm)，推測(cè)其可能的分子式。然后依據(jù)MS/MS碎片信息比對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)metlin(http∶//metlin.scripps.edu)、human metabolome database(http∶//www.hmdb.ca)、massbank(http∶//www.massbank.jp/)、lipidMaps(http∶//www.lipidmaps.org)、mzclound(https∶//www.mzcloud.org)確認(rèn)差異代謝物。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Mann-Whitney-Wilcoxon Test檢驗(yàn)篩選差異代謝物，模型的質(zhì)量用交叉驗(yàn)證法進(jìn)行檢驗(yàn)，并使用置換檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估模型是否過(guò)度擬合。

結(jié) 果

一、總離子流色譜圖

正離子模式獲得893個(gè)前體分子，負(fù)離子模式獲得1 878個(gè)前體分子，對(duì)照組、MAP組、MSAP+SAP組間代謝物差異顯著(圖1)。

圖1 尿液樣本正離子模式(1A)及負(fù)離子模式(1B)的離子流色譜圖

二、PCA分析

正離子模式共有14個(gè)主成分，負(fù)離子模式13個(gè)主成分。對(duì)X變量數(shù)據(jù)集模型的可解釋度(R2X)值分別為0.569、0.500，均>0.5，提示模型具有很好的可解釋度；模型可預(yù)測(cè)度(Q2)值分別為0.162、0.151，均偏低，提示可預(yù)測(cè)度稍低。

對(duì)照組與AP組PCA得分見圖2A，第一主成分R2X=0.1240，第二主成分R2Y=0.0784，兩組尿液樣本具有較好的區(qū)分聚類趨勢(shì)，獲得了較好的分類模型。

對(duì)照組、MAP組、MSAP+SAP組的PCA得分見圖2B，MSAP+SAP組與MAP組有一定的區(qū)分聚類趨勢(shì)，但并不顯著。

圖2 對(duì)照組與AP組(2A)及對(duì)照組與MAP組、MSAP+SAP組(2B)的PCA得分圖。橫坐標(biāo)為樣本第一主成分的得分，縱坐標(biāo)為第二主成分的得分

三、PLS-DA分析

對(duì)照組與AP組的正、負(fù)離子模式的主成分?jǐn)?shù)均為4個(gè)，R2X值分別為0.267、0.250，R2Y值分別為0.960、0.985，Q2值分別為0.898、0.914，兩組的差異進(jìn)一步凸顯，兩組樣本呈明顯的區(qū)分聚類，且具有較高的可預(yù)測(cè)性(圖3A)，PLS-DA置換檢驗(yàn)圖顯示模型擬合良好(圖3B)，評(píng)價(jià)模型可靠有效。

對(duì)照組、MAP組、MSAP+SAP組的PLS-DA得分圖見圖3C，第一主成分R2X=0.0782，第二主成分R2Y=0.0877，Elipser∶Hotelling′s T2(95%)，3組間具有較明顯的分類趨勢(shì)，獲得了較好的分類模型。PLS-DA置換檢驗(yàn)圖(圖3D)同樣提示模型可靠，沒(méi)有過(guò)度擬合。

四、差異代謝物篩選

AP組尿液小分子代謝物中有116個(gè)前體離子水平較對(duì)照組上升，154個(gè)前體離子水平較對(duì)照組下降。共篩選并鑒定出17個(gè)差異代謝物(表3)，其中壬二酸、當(dāng)歸酸、癸二酸、馬尿酸、酮戊二酸、琥珀酸、脯氨酸水平下降，琥珀酸半醛、D-β-羥基丁酸、乙酰肉堿、蘋果酸、4-吡哆酸、甘露醇、C16鞘氨醇、亮氨酸、纈氨酸、L-肉堿水平升高。壬二酸、琥珀酸半醛、D-β-羥基丁酸、乙酰肉堿、當(dāng)歸酸、癸二酸、馬尿酸7個(gè)代謝物的AUC>0.8，將它們整合后繪制ROC曲線見圖4，AUC=0.9904，95%CI0.975～0.999，對(duì)AP的診斷敏感性為100%，特異性為94%。

MSAP+SAP組尿液的琥珀酸半醛、D-β-羥基丁酸、乙酰肉堿、蘋果酸、當(dāng)歸酸的水平較MAP組及對(duì)照組顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將上述5種差異代謝物整合后繪制ROC曲線見圖5，MSAP+SAP組與對(duì)照組的AUC=0.956，95%CI0.881～0.997，對(duì)MSAP+SAP的診斷敏感性為90%，特異性為90%；MSAP+SAP組與MAP組的AUC=0.849，95%CI0.737～0.929，對(duì)MSAP+SAP的診斷敏感性為85%，特異性為78%，具有很好的診斷價(jià)值。

討 論

當(dāng)前代謝組學(xué)已被廣泛地應(yīng)用于各種疾病的代謝組特征研究、生物標(biāo)志物的挖掘、診斷模型的建立以及一些藥物的療效評(píng)價(jià)等各個(gè)方面。胰腺炎相關(guān)代謝的研究也獲得了一定的進(jìn)展，然而對(duì)于不同嚴(yán)重程度的胰腺炎的代謝特征則少有描述。本研究通過(guò)建立不同的分析模型，篩選并鑒定出壬二酸、琥珀酸半醛、D-β-羥基丁酸、乙酰肉堿、當(dāng)歸酸、癸二酸、馬尿酸對(duì)AP具有潛在診斷價(jià)值的代謝物，琥珀酸半醛、D-β-羥基丁酸、乙酰肉堿、蘋果酸、當(dāng)歸酸5個(gè)對(duì)重癥AP具有潛在診斷價(jià)值的代謝物。

圖3 對(duì)照組與AP組(3A、3B)及對(duì)照組與MAP組、MSAP+SAP組(3C、3D)的PLS-DA得分圖和PLS-DA置換檢驗(yàn)圖

代謝物名稱質(zhì)核比保留時(shí)間(s)(min)電離模式精確分子量理論與檢測(cè)分子量誤差理論分子式壬二酸187.0972487.823008.13-188.10491C9H16O4琥珀酸半醛101.0250165.491002.76-102.03175C4H6O3D-β-羥基丁酸103.0412174.592002.91-104.047310C4H8O3乙酰肉堿204.1249122.707002.05+203.11589C9H17NO4當(dāng)歸酸101.060711.703450.20+100.052410C5H8O2癸二酸201.1125403.918006.73-202.12053C10H18O4馬尿酸178.0508375.848006.26-179.05821C9H9NO3蘋果酸133.0144106.663001.78-134.02150C4H6O54-吡哆酸184.0599141.725502.36+183.05322C8H9NO4D-甘露糖醇181.0716923.7625015.40-182.07901C6H14O6纈氨酸118.087389.347101.49+117.07909C5H11NO2酮戊二酸145.0141115.909501.93-146.02151C5H6O5琥珀酸117.0197164.512002.74-118.02663C4H6O4脯氨酸116.0717123.268002.05+115.06339C5H9NO2C16二氫神經(jīng)鞘氨醇274.2765694.5570011.58+273.26688C16H35NO2苯丙氨酸166.0878255.111504.25+165.07909C9H11NO2色氨酸205.0991307.806005.13+204.08999C11H12N2O2

圖4 對(duì)照組與AP組7個(gè)差異代謝物整合后的ROC曲線

圖5 對(duì)照組與MSAP+SAP組(5A)、MSAP+SAP組與MAP組(5B)尿液5個(gè)差異代謝物整合后的ROC曲線

三羧酸循環(huán)是人和動(dòng)物體內(nèi)最重要的能量代謝通路，參與三羧酸循環(huán)的中間代謝物蘋果酸含量在AP患者尿液中明顯升高，且隨病情的加重而遞增，這與既往研究結(jié)論相似[8-10]，提示隨著胰腺炎病情的進(jìn)展，機(jī)體更傾向于發(fā)展為一個(gè)高動(dòng)力和高代謝狀態(tài)，從而導(dǎo)致更高的能源需求或能源供應(yīng)相對(duì)不足[11]，三羧酸循環(huán)失衡導(dǎo)致部分代謝物水平發(fā)生變化。

β-羥基丁酸是一種酮體，是在肝臟中通過(guò)3-羥基丁酸脫氫酶催化的反應(yīng)中由乙酰輔酶合成的。 AP時(shí)由于機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)，腎上腺素、胰高血糖素、腎上腺皮質(zhì)激素分泌相應(yīng)增加，以及禁食等綜合因素的作用，機(jī)體的糖異生調(diào)節(jié)增強(qiáng)，大量脂肪動(dòng)員水解生成游離脂肪酸和三酰甘油，進(jìn)一步氧化分解成大量的乙酰輔酶A。而此時(shí)正常的三羧酸循環(huán)受到抑制，從而導(dǎo)致乙酰輔酶A在三羧酸循環(huán)失速，朝著酮體生產(chǎn)的方向移位[12]，因此AP患者尿液中β-羥基丁酸含量顯著升高。

乙酰肉堿在細(xì)胞呼吸中作為傳遞脂肪酸進(jìn)入線粒體的工具，幫助脂肪酸進(jìn)入線粒體從而產(chǎn)生能量體ATP[13]。既往研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠的AP模型中肉堿對(duì)胰腺組織起保護(hù)作用，這一功能可能是通過(guò)對(duì)氧化/抗氧化平衡的調(diào)節(jié)，以及在髓過(guò)氧化物酶和一氧化氮系統(tǒng)這些AP相關(guān)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的[14]。本研究結(jié)果顯示，AP患者尿液中的乙酰肉堿水平隨疾病嚴(yán)重程度升高也提示脂肪代謝隨病情加重而增加。此外乙酰肉堿還具有多種膽堿類功能，包括釋放并合成乙酰膽堿同時(shí)增加NF-κB的乙酰化和激活轉(zhuǎn)錄因子活性從而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，以及穩(wěn)定細(xì)胞膜、免疫調(diào)節(jié)及抑制炎癥反應(yīng)的作用，在某種程度上也反映了機(jī)體在胰腺炎的病理生理狀態(tài)中進(jìn)行的自我調(diào)節(jié)。

琥珀酸半醛涉及維生素B6、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丁酸以及酪氨酸等多條代謝通路，它主要由γ-氨基丁酸在轉(zhuǎn)氨酶作用下降解形成。其濃度升高的變化提示了胰腺炎的狀態(tài)下機(jī)體氨基酸代謝也出現(xiàn)相應(yīng)的變化。

馬尿酸又稱苯甲酰氨基乙酸，甲苯進(jìn)入機(jī)體后經(jīng)代謝轉(zhuǎn)化，大部分生成馬尿酸，并隨尿排出。尿液中馬尿酸的含量可以在某種程度上反映肝臟的解毒功能。腎血流量減少和腎排泄功能障礙也能使馬尿酸排出量減少。故馬尿酸下降可能與AP患者肝腎功能一定程度的受損有關(guān)。另有報(bào)道稱其含量改變與腸道微生物活動(dòng)變化有關(guān)[15]。

壬二酸是一種脂肪酸，其作用包括抑制活性氧自由基的產(chǎn)生和作用，有利于抗炎，破壞細(xì)胞線粒體呼吸，抑制細(xì)胞合成，從而抑制細(xì)胞增殖。當(dāng)歸酸屬于支鏈脂肪酸，具有一定的鎮(zhèn)靜作用。本組AP患者尿液中壬二酸、當(dāng)歸酸水平下降，提示AP患者的脂肪酸代謝出現(xiàn)紊亂。癸二酸屬于脂肪族二元酸，通常脂肪分解增加、肪酸氧化代謝增強(qiáng)可導(dǎo)致癸二酸水平升高，但是本組AP患者尿液中癸二酸水平下降，其原因有待進(jìn)一步研究。

本研究篩選出的特征性差異代謝物為AP的診斷及嚴(yán)重程度的評(píng)估提供了新的研究思路。尿液取樣方便且無(wú)創(chuàng)，但易受到飲食、飲水量以及腎功能等因素的影響，尚需與血清的代謝組學(xué)研究結(jié)果相互驗(yàn)證和補(bǔ)充。此外，本組樣本數(shù)有限，尚需更大樣本量來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)論。

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Urinemetabolomicsanalysisofpatientswithacutepancreatitis

LiuShenglan,GuoQiang,YangXinjing,SunXue,ZhaoDaguo,XuJun,ChenWeichang.

DepartmentofEmergencyandIntensiveCareUnit,FirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215000,China

ChenWeichang，Email：weichangchen@126.com

ObjectiveTo detect the small molecular metabolite profiles of urine from patients with acute pancreatitis (AP) in different severity, and screen the differential metabolites that have potential diagnostic value for AP and its severity.MethodsUrine samples were collected from 65 AP patients (MSAP and SAP 29, MAP 36) in the First Affiliated Hospital of Soochow University, and 25 healthy volunteers served as controls. The liquid chromatograph mass spectrometer (LC-MS) combined method was used to detect urine small molecule metabolites of AP patients and healthy controls. Multivariate statistical analysis was used to establish and validate the principal component analysis (PCA) model and partial least squares discriminate analysis (PLS-DA) model to select the differential metabolites.ResultsPCA model had a good degree of interpretation (R2X>0.5), and each group of urine samples showed a good distinction between clustering trends, and good classification models were obtained. In the PLS-DA model，the differences among groups were further highlighted, and samples of each group showed distinct differentiation between clusters, with high predictability (Q2>0.7). The model was reliable and effective indicated by the PLS-DA permutation test. 17 differential metabolites were screened out by comparing AP with control. A diagnostic model constructed with 7 differential metabolites including nonanedioic acid, succinic acid semialdehyde, D-beta-hydroxy butyric acid, acetylcarnitine, angelic acid, sebacic acid and hippuric acid had a high diagnostic value for AP, with the sensitivity of 100% and the specificity of 94%. Then control, MAP and MSAP+SAP group were compared with each other, and it was found that the model integrating urine succinic acid semialdehyde, angelic acid, D(-)-beta-hydroxy butyric acid, malic acid and acetylcarnitine had a good diagnostic value for SAP, with the sensitivity and specificity of both 90%.ConclusionsLC-MS metabolomics can effectively identify the changes of urine metabolism in patients with different severity of AP. The screened differential metabolites have the potential clinical value in the diagnosis and classification of AP.

Pancreatitis； Metabolomics； Liquid chromatography-mass spectrometry; Biological markers

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.06.006

215000 江蘇蘇州，蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科(急診ICU)(劉盛蘭、郭強(qiáng)、楊新靜、孫雪、趙大國(guó))，消化內(nèi)科(徐俊、陳衛(wèi)昌)

陳衛(wèi)昌，Email:weichangchen@126.com

2017-06-13)

冀凱宏)