青藤堿關節(jié)腔注射對兔膝骨關節(jié)炎模型血清及滑液內(nèi)脂素及抵抗素的影響

鄭　潔　寇久社　王瑞輝

(陜西中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，陜西　西安　712046)

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青藤堿關節(jié)腔注射對兔膝骨關節(jié)炎模型血清及滑液內(nèi)脂素及抵抗素的影響

鄭潔寇久社1王瑞輝

(陜西中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，陜西西安712046)

目的觀察青藤堿關節(jié)腔注射對兔膝骨關節(jié)炎模型血清及滑液中脂肪因子內(nèi)脂素及抵抗素含量的影響。方法38只新西蘭大白兔隨機分為正常組、模型組、透明質(zhì)酸鈉組和青藤堿組。正常組不予任何處理，模型組、透明質(zhì)酸鈉組和青藤堿組通過木瓜蛋白酶關節(jié)腔注射法誘導膝骨關節(jié)炎模型后，分別用生理鹽水、透明質(zhì)酸鈉和青藤堿干預，5 w后檢測并比較各組血清及滑液中內(nèi)脂素及抵抗素含量。結(jié)果各組間血清內(nèi)脂素含量均無明顯差異(P>0.05)；模型組滑液內(nèi)脂素含量較其他各組明顯升高(P<0.05)，青藤堿組較透明質(zhì)酸鈉組低(P<0.05)。模型組血清及滑液中抵抗素含量較其他各組均顯著升高(P<0.05)，青藤堿組血清及滑液中抵抗素含量與透明質(zhì)酸鈉組比較無顯著差異(P<0.05)。 結(jié)論青藤堿膝關節(jié)腔注射可降低兔膝骨關節(jié)炎模型滑液內(nèi)脂素水平及血清、滑液中抵抗素水平。

青藤堿；關節(jié)腔內(nèi)注射；骨關節(jié)炎；內(nèi)脂素；抵抗素

骨關節(jié)炎(OA)是由多因素造成的關節(jié)退行性疾病，以關節(jié)軟骨破壞、軟骨下骨變化、骨贅形成以及滑膜炎癥為主要特征。炎癥在OA的發(fā)生發(fā)展過程中起到了不可忽視的作用，炎癥可能是OA的原發(fā)事件，也可能是關節(jié)軟骨生化變化的繼發(fā)事件〔1〕。近年來發(fā)現(xiàn)，脂肪細胞因子除參與調(diào)節(jié)糖脂代謝，在炎癥過程以及OA發(fā)病中均發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用〔2，3〕。青藤堿是從傳統(tǒng)治療風濕性疾病中藥清風藤中提取的一種生物堿，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、降血壓、抗心律失常等藥理作用〔4〕。青藤堿在骨關節(jié)病中的臨床及實驗研究目前仍主要集中在類風濕性關節(jié)炎，而應用于OA的研究非常少。本實驗擬探討青藤堿治療膝骨關節(jié)炎的部分作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組新西蘭大白兔38只，雌雄各半，體重1.8～2.2 kg，由西安交大醫(yī)學院實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(陜)2008-008。適應性喂養(yǎng)1 w后，隨機分為4組：正常組、模型組、透明質(zhì)酸鈉組和青藤堿組。其中正常組8只，其余各組均為10只。

1.2試劑與儀器內(nèi)脂素及抵抗素試劑盒(北京諾博萊科技有限公司)，正清風痛寧注射液(湖南正清制藥集團股份有限公司，批號1304402-003，規(guī)格2 ml∶50 mg)，玻璃酸鈉注射液(山東博士倫福瑞達制藥有限公司，批號130308011，規(guī)格2 ml∶20 mg)，木瓜蛋白酶(Merck公司，貨號107147，活力6000 USP-U/mg)，Bio-Tec ELX808型酶標儀(美國Bio-Tec公司)，HH·W21·420型電熱恒溫水浴箱(天津市泰斯特儀器有限公司)，KDC-40型低速離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)。

1.3方法

1.3.1模型制備造模方法采用木瓜蛋白酶關節(jié)腔注射法，分別于實驗的第1、4、7天對造模組兔進行關節(jié)腔注射，首次注射4 w后兔右膝關節(jié)出現(xiàn)腫脹、跛行，表明造模成功。

1.3.2木瓜蛋白酶溶液配制將木瓜蛋白酶按4%(20 mg/0.5 ml)的濃度溶解于生理鹽水中，裝入50 ml 無菌瓶中并置于 0～4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3注射方法兔右膝關節(jié)備皮、75%乙醇消毒后，用左手從下方和兩旁將右側(cè)膝關節(jié)輕度屈曲位固定，右手持1 ml注射器在髕韌帶附著點外上方約 0.5 cm 處向髁間窩方向進針，當出現(xiàn)落空感時表明已進入關節(jié)腔內(nèi)，注入0.5 ml 4%木瓜蛋白酶水溶液。

1.3.4干預措施根據(jù)成人用藥劑量(透明質(zhì)酸鈉和青藤堿均為2 ml/次)按Meeh-Rubner公式計算人兔等效劑量。除正常組外，對各組動物造模側(cè)膝關節(jié)行關節(jié)腔注射，青藤堿組膝關節(jié)腔注射鹽酸青藤堿注射液0.2 ml(5 mg)，1次/3 d，10次1個療程，共給藥10次；透明質(zhì)酸鈉組膝關節(jié)腔注射透明質(zhì)酸鈉注射液0.2 ml，1次/6 d，5次1個療程，共5次；模型組膝關節(jié)腔注射生理鹽水0.2 ml，注射次數(shù)同青藤堿組。共干預30 d。

1.3.5標本采集①血清采集：干預結(jié)束后，耳中動脈取血5 ml，4 000 r/min離心10 min，分離血清后-80℃冰箱保存?zhèn)錂z。②滑液采集：干預結(jié)束后，生理鹽水沖洗法收集滑液。于兔的右膝關節(jié)腔內(nèi)注入生理鹽水注射液1 ml(注射方法同前)，充分活動膝關節(jié)使生理鹽水與關節(jié)滑液充分混合，再抽取關節(jié)腔生理鹽水沖洗液0.6～1 ml至EP管，4 000 r/min離心10 min，取上清，-80℃保存?zhèn)錂z。

1.3.6指標檢測采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定血清和滑液中內(nèi)脂素及抵抗素的含量。操作方法嚴格按照試劑盒說明進行。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS19.0軟件行單因素方差分析。

2　結(jié)　果

2.1肉眼觀察實驗過程中，模型組、透明質(zhì)酸鈉組及青藤堿組兔各死亡1只，各組實驗兔最終為正常組8只，模型組、透明質(zhì)酸鈉組及青藤堿組各9只。正常組：滑膜未見明顯改變，關節(jié)軟骨表面呈淺藍白色，光滑而有光澤，無糜爛。模型組：滑膜充血腫脹，關節(jié)軟骨表面粗糙、肥厚，色澤變暗，伴有裂紋、糜爛，部分軟骨下骨質(zhì)暴露，滑液量多，色黃，質(zhì)稠。透明質(zhì)酸鈉組：滑膜輕度腫脹，關節(jié)軟骨表面欠光滑，部分可見裂紋，尚未見軟骨下骨質(zhì)暴露。青藤堿組：滑膜輕度腫脹，關節(jié)軟骨略粗糙，糜爛程度較模型組輕。

2.2血清及滑液內(nèi)脂素含量測定兔膝骨關節(jié)炎模型血清中內(nèi)脂素含量無明顯變化，正常組與其他各組血清內(nèi)脂素含量比較均無顯著差異(P>0.05)。模型組滑液內(nèi)脂素含量較正常組、透明質(zhì)酸鈉組和青藤堿組均顯著升高(P<0.05)，青藤堿組滑液內(nèi)脂素含量與正常組比較無顯著差異(P>0.05)，與透明質(zhì)酸鈉組比較呈顯著差異(P<0.05)，見表1。

表1　各組兔血清及滑液內(nèi)脂素含量比較±s,μg/L)

與模型組比較:1)P<0.05；與透明質(zhì)酸鈉組比較比較:2)P<0.05

2.3血清及滑液抵抗素含量測定模型組血清及滑液中抵抗素含量較正常組、透明質(zhì)酸鈉組和青藤堿組均顯著升高(P<0.05)，青藤堿組血清及滑液中抵抗素含量與正常組比較有顯著差異(P<0.05)，與透明質(zhì)酸鈉組比較無顯著差異(P>0.05)，見表2。

表2　各組兔血清及滑液抵抗素含量比較±s,μg/L)

與正常組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05

3　討　論

脂肪細胞因子是一類由白色脂肪組織分泌的內(nèi)源性活性多肽，在OA病理生理過程中發(fā)揮了重要作用，既可作為前炎(或促炎)細胞因子參與OA炎癥過程；也可獨立地或與一些炎性因子協(xié)同作用，通過軟骨基質(zhì)降解酶加速OA后期軟骨蛻變過程〔3〕。內(nèi)脂素最早發(fā)現(xiàn)于肝臟、骨髓和肌肉，后來發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟脂肪組織也可分泌內(nèi)脂素。OA患者髕下脂肪墊和滑液中內(nèi)脂素含量均顯著增高〔5，6〕，且滑液中內(nèi)脂素水平與軟骨降解產(chǎn)物Ⅱ型膠原和蛋白聚糖含量呈正相關，表明內(nèi)脂素參與OA軟骨基質(zhì)的降解過程〔6〕。抵抗素在多種炎癥性疾病的發(fā)病中起到了重要的調(diào)控作用。創(chuàng)傷性關節(jié)炎患者血清和滑液抵抗素的含量均明顯提高〔7〕。經(jīng)抵抗素誘導后，人軟骨細胞中多種趨化因子和細胞因子的基因表達均上調(diào)，證實抵抗素可能作為致炎因素參與了OA炎癥反應，并加速了軟骨的降解過程〔8〕。本實驗發(fā)現(xiàn)，木瓜蛋白酶誘導兔膝骨關節(jié)炎模型滑液中內(nèi)脂素和血清及滑液抵抗素水平均顯著提高，進一步證實內(nèi)脂素和抵抗素等脂肪因子參與OA病理過程。臨床研究表明，青藤堿可緩解OA患者膝關節(jié)疼痛、腫脹及晨僵等癥狀，顯著改善膝關節(jié)功能障礙〔9，10〕。青藤堿膝關節(jié)腔注射后，關節(jié)腔滑液中TNF-α、IL-1β、IL-6及PGE2含量顯著下降〔11～13〕，提示青藤堿對OA軟骨具有保護作用，其機制可能與其抗炎作用有關。本實驗結(jié)果表明青藤堿關節(jié)腔注射抗OA作用可能與影響內(nèi)脂素和抵抗素等脂肪因子水平密切相關。

1Rainbow R，Ren WP，Zeng L.Inflammation and joint tissue interactions in OA：implications for potential therapeutic approaches〔J〕.Arthritis，2012;2012：741582.

2Gualillo O，Gonz′alez-Juanatey JR，Lago F，etal.The emerging role of adipokines as mediators of cardiovascular function：physiologic and clinical perspectives〔J〕.Trends Cardiovasc Med，2007;17(8)：275-83.

3Conde J，Scotece M，Gomez R，etal.Adipokines and osteoarthritis：novel molecules involved in the pathogenesis and progression of disease〔J〕.Arthritis，2011;2011：203901.

4季宇彬.中藥有效成分藥理與應用〔M〕.哈爾濱：黑龍江科學技術(shù)出版社，1995:427.

5Duan Y，Hao D，Li M，etal.Increased synovial fluid visfatin is positively linked to cartilage degradation biomarkers in osteoarthritis〔J〕.Rheumatol Int，2012;32(4)：985-90.

6Klein-Wieringa IR，Kloppenburg M，Bastiaansen-Jenniskens YM，etal.The inflapatellar fat pad of patients with osteoarthritis has an inflammatory phenotype〔J〕.Ann Rheum Dis，2011;70(5)：851-7.

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10譚志明，李久峰.正清風痛寧和塞來昔布改善骨性關節(jié)炎功能障礙的效果分析〔J〕.中國臨床康復，2002;6(14)：2132-3.

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12楊惠琴，陳禮榮.青藤堿對膝骨性關節(jié)炎實驗兔關節(jié)液及血清中TNF-α 水平的影響〔J〕.中華物理醫(yī)學與康復雜志，2008;30(7)：448-50.

13吳紅娟，孫必強，朱傳湘，等.鹽酸青藤堿對家兔骨關節(jié)炎關節(jié)液IL-1β、PGE2 生成與關節(jié)組織結(jié)構(gòu)的影響〔J〕.湖南中醫(yī)藥大學學報，2010;30(9)：84-6.

〔2014-12-09修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

陜西省中醫(yī)康復學重點學科建設項目(陜中醫(yī)藥發(fā)〔2011〕46號)；陜西省教育廳科學研究項目(14JK1209)

鄭潔(1978-)，女，副教授，博士，主要從事骨關節(jié)及骨代謝性疾病的中醫(yī)康復研究。

R285

A

1005-9202(2016)16-3904-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.015

1陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院