一種萃取酒醅中低沸點揮發(fā)性成分的方法

郭家秀，張宿義，趙金松，3，，吳衛(wèi)宇，蘇占元，楊建剛*

（1.四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000；3.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川 瀘州 646000；4.國家酒類產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，四川 瀘州 646000）

一種萃取酒醅中低沸點揮發(fā)性成分的方法

郭家秀1，張宿義2，3，趙金松1，3，4，吳衛(wèi)宇4，蘇占元4，楊建剛1*

（1.四川理工學(xué)院 生物工程學(xué)院，四川 自貢 643000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川 瀘州 646000；3.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川 瀘州 646000；4.國家酒類產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，四川 瀘州 646000）

分別采用水蒸汽蒸餾（SD）法、超聲輔助溶劑萃?。║ASE）法和蒸餾-微溶劑萃取（SD-MSE）法從濃香型白酒酒醅中提取揮發(fā)性成分，利用峰面積歸一化法測定各成分的相對含量，通過對揮發(fā)性成分的氣相色譜-質(zhì)譜連用/自動化退卷積系統(tǒng)（GC-MS/AMDIS）對比分析。結(jié)果表明，SD、UASE及SD-MSE法分別鑒定出42種、71種、60種揮發(fā)性成分。SD、UASE及SD-MSE法分別測得的醇、酸、酯的相對含量分別為1.34%、6.61%、21.67%；1.03%、39.28%、37.42%；3.96%、9.97%、64.97%。由此可知，SD法對酸、酯的提取效果劣于另兩種方法，UASE法對酸類物質(zhì)萃取效果更佳，SD-MSE法對酯類物質(zhì)的萃取效果更佳。和UASE法相比，SD-MSE法節(jié)約了大量溶劑，減少了樣品轉(zhuǎn)移次數(shù)，且待測液澄清透明，是一種適宜萃取糟醅中低沸點成分的方法。

水蒸汽蒸餾法；超聲輔助溶劑萃取法；蒸餾-微溶劑萃取法；氣相色譜-質(zhì)譜連用/自動化退卷積

中國白酒是世界著名的蒸餾酒之一，它獨特的生產(chǎn)工藝是千百年來我國勞動人民生產(chǎn)經(jīng)驗的總結(jié)和智慧的結(jié)晶[1]。我國白酒歷史悠長，分布廣泛，由于技術(shù)發(fā)展、原料改變、生產(chǎn)工藝的差異以及不同地區(qū)人們對不同白酒的喜愛，形成了我國白酒種類繁多、風格多樣的特點[2]。白酒中的微量成分雖然含量極少，但對酒質(zhì)卻有很大影響，決定著白酒的香氣和口味，構(gòu)成白酒的香型和風格，故風味物質(zhì)近年來一直是研究的熱點。

濃香型白酒又稱瀘香型酒，是中國白酒中的一朵奇葩，占據(jù)較大的市場份額。酒醅在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的風味物質(zhì)，與成品酒的風味物質(zhì)有密切的關(guān)系，因此也是科研者關(guān)注的對象。然而固態(tài)發(fā)酵酒醅是非常復(fù)雜且不均勻的物質(zhì)體系，除55%左右的水分和4%左右的乙醇外，還有糧食皮殼、殘余淀粉、糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸以及無機鹽等，但種類眾多的香味成分的含量卻很低。由于酒醅與白酒的質(zhì)量比約為（15～30）∶1，所以酒醅中香味成分的含量僅相當于白酒中的1/20左右[3]，使得酒醅中各微量香味成分的提取及定量檢測難以進行。因此，探索酒醅中香味成分的提取檢測方法具有十分重要的意義。

自動質(zhì)譜退卷積定性系統(tǒng)（automated mass spectral deconvolution&identification system，AMDIS）能夠?qū)赓|(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）全掃描文件中的色譜圖自動去卷積處理，提取出每個成分的“純凈”質(zhì)譜圖和相關(guān)信息，并將這些信息與目標譜庫進行比較，鑒定報告出匹配因子值大于設(shè)定值的色譜峰成分[4]。

常用的風味物質(zhì)提取方法主要有同時蒸餾萃取[5-6]、加速溶劑萃取[7]、溶劑輔助風味蒸發(fā)[8]、固相萃取[9]、固相微萃取[10]、頂空分析（或制樣）法[11]、熱脫附法[12]、溶劑萃取法[13]，直接蒸餾法[14]等，其中，操作相對容易的是頂空吸附法、溶劑萃取法和直接蒸餾法。頂空吸附法（包括靜態(tài)頂空和動態(tài)頂空[15]）因為操作簡便快速，無溶劑，樣品用量少等優(yōu)點，使用廣泛[16-19]，但是使用成本較高，特別是樣品比較多的情況，并且頂空中成分的相對濃度并不能反⒊樣品中的濃度，因為香味物質(zhì)的揮發(fā)性不一樣；溶劑萃取法相對容易操作，風味化合物具有良好的回收率，在所有的方法中，定量效果最好，但使用了大量的溶劑，會造成污染，并且萃取物里面可能含有不易揮發(fā)的成分，會污染色譜柱；直接蒸餾法操作最容易，產(chǎn)品中不含任何高沸點的組分或非揮發(fā)性的成分，不會污染氣相色譜（gaschromatography，GC）的進樣口和柱子，無溶劑，不會造成污染，但可能有些成分不會出現(xiàn)在萃取物中，或者濃度極低。本研究旨在選擇一種成本較低、比較容易操作且不會污染GC進樣口和柱子的糟醅預(yù)處理方法，因此就水蒸氣蒸餾（steam distillation，SD）法、超聲輔助溶劑萃取（ultrasonic assisted solvent extraction，UASE）法和蒸餾-微溶劑萃?。╯team distillationmicroextraction，SD-MSE）法3種方式進行比較，分析這三種方式的萃取效果，對酒醅中低沸點揮發(fā)性成分的提取提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糟醅：出窖糧食糟，取自四川南部某名酒廠；氯化鈉（分析純）、乙醚（色譜純）：成都市科龍化工試劑廠；實驗用水均為超純水，由本實驗室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 7890B GC/5977MSD氣質(zhì)聯(lián)用儀、DB-WAX色譜柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）：美國Agilent公司；JA5003電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；SK-1渦旋混勻器：金壇市醫(yī)療儀器廠；AS3120超聲波清洗儀：北京華瑞博遠科技發(fā)展有限公司；RE5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；N-EVAPTM111氮吹儀：美國Organomation公司；DL-1電子萬用爐：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 糟醅預(yù)處理方法

（1）水蒸氣蒸餾法

稱取25.00 g糟醅，加入50 mL飽和食鹽水，常壓蒸餾，接取餾出液25 mL，冷藏待測。

（2）超聲輔助溶劑萃取法

稱取25.00 g糟醅，加入35 mL乙醚，用快速混勻器混勻，超聲萃取頻率40 kHz，功率120 W，水溫20℃，超聲萃取時間30 min，過濾，收集濾液將濾渣再用25 mL萃取溶劑萃取兩次，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃條件下濃縮到5～10 mL，最后用氮吹儀濃縮至0.5 mL，后用相同的萃取溶劑定容至1 mL，用0.45 μm孔徑的濾膜過濾，待測。

（3）蒸餾-微溶劑萃取法

按照（1）中的方法直接水蒸氣蒸餾后，取5 mL餾出液于25 mL試管中，加入2 mL萃取溶劑，渦旋混勻器混勻，靜置分層，取有機相用0.45 μm孔徑的濾膜過濾，待測。

1.3.2 GC-MS分析條件

GC色譜條件：DB-Wax毛細管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；載氣：氦氣（He），流速：2 mL/min，不分流；柱溫：進樣口溫度保持在250℃，起始氣相色譜柱溫在40℃維持3min，之后5℃/min升溫至60℃，再以10℃/min升溫至230℃，維持8 min，共計32 min。

MS質(zhì)譜條件：離子源溫度為200℃；接口溫度為250℃；電離方式采用電子電離（electronic ionization，EI）源；電子能量：70 eV；掃描質(zhì)量范圍：33～450 m/z；溶劑延遲時間：2.2 min。

定性定量方法：采用美國國家標準技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）11a.L譜庫，運用自動質(zhì)譜退卷積定性系統(tǒng)（AMDIS）分析定性，采用峰面積歸一化法定量。

2 結(jié)果與分析

與水蒸氣蒸餾法和超聲輔助溶劑萃取法相比，蒸餾-微溶劑萃取法是先將樣品進行水蒸汽蒸餾，然后取少量蒸餾液加入萃取劑利用渦旋輔助萃取，這種方法能夠節(jié)約大量有機溶劑，避免環(huán)境污染，同時又能將蒸餾液中濃度較低的成分進行濃縮，微萃取能減少使用大量溶劑時樣品經(jīng)過多次轉(zhuǎn)移而造成的成分損失，操作時間更短。由3種方法的總離子流色譜圖（totalionchromatogram，TIC）見圖1。由圖1可知，3種方法所得TIC圖差異較大，表明這三種方法可能存在明顯差異，需要利用質(zhì)譜信息對化學(xué)成分進行進一步比對。

對于某些極性和結(jié)構(gòu)類似的化合物，色譜能夠分離的能力有限，因此在TIC色譜圖中會出現(xiàn)多種化合物部分或者完全重疊，從而導(dǎo)致不同物質(zhì)的質(zhì)譜圖相互交錯重疊的情況，這時進行譜庫檢索會造成嚴重干擾，因而獲得的結(jié)果往往相似度較低。而應(yīng)用自動質(zhì)譜退卷積定性系統(tǒng)（AMDIS）則可以對TIC圖自動進行反卷積處理，從相互重疊的質(zhì)譜圖中分離、辨識出單個化合物的質(zhì)譜信息以及相關(guān)色譜保留時間。利用這些單一化合物的質(zhì)譜信息進行譜庫檢索就可以篩選出相似度大于設(shè)定閥值的化合物，還可以從復(fù)雜組分中鑒定出目標化合物，這一能力使其成為質(zhì)譜重疊峰的成分分析的重要技術(shù)手段[20]。本研究利用AMDIS對3種方法提取所得糟醅揮發(fā)性成分的TIC圖進行辨識，在設(shè)定相似度閥值為75%的情況下，從中共鑒定出95種物質(zhì)，利用面積歸一化法計算揮發(fā)性成分的相對百分含量，結(jié)果見表1。

圖1 三種提取方法所得糟醅揮發(fā)性成分的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile compounds in Zaopei by the three extraction methods

由表1可知，水蒸氣蒸餾法測得的揮發(fā)性成分共42種（醇類11種，酯類10種，酸類9種，醛酮類4種，酚類6種，其他類2種），其中醇類占69.68%，酯類25.96%，酸類2.37%，其他類0.86%；超聲輔助溶劑萃取法共測得的揮發(fā)性成分71種（醇類12種，酯類32種，酸類20種，醛酮類2種，酚類4種，其他類1種），其中醇類14.49%，酯類37.42%，酸類39.27%，其他類0.89%；蒸餾-微溶劑萃取法共測得的揮發(fā)性成分60種（醇類13種，酯類30種，酸類6種，醛酮類4種，酚類5種，其他類2種）醇類26.16%，酯類64.97%。酸類9.97%，其他類1.12%。經(jīng)分析，3種方法測得的共有物質(zhì)有23種，其中，醇類8種，分別是乙醇、正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、（2S，3S）-（+）-2,3-丁二醇、（2R，3R）-（-）-2,3-丁二醇以及苯乙醇，酯類物質(zhì)7種，有乙酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、苯丙酸乙酯；酸類6種，包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸、己酸；其他類2種，為4-甲基Ⅹ創(chuàng)木酚，2,3-二氫苯并呋喃。

表1 三種提取方法所得糟醅揮發(fā)性成分檢測結(jié)果Table 1 Determination results of the volatile compounds in Zaopei by the three extraction methods

續(xù)表

續(xù)表

由表1可知，水蒸氣蒸餾法、超聲輔助溶劑萃取法和蒸餾-微溶劑萃取法3種方法提取檢測的物質(zhì)種類數(shù)及相對含量均存在差異，水蒸氣蒸餾法檢測到的成分種類僅42種，少于后兩種方法的71種和60種，其中酯類成分種類數(shù)僅10種，遠小于超聲輔助溶劑萃取法和蒸餾-微溶劑萃取法的32種和30種，表明水蒸氣蒸餾法不利于對糟醅中酯類成分的萃取。超聲輔助溶劑萃取法比蒸餾-微溶劑萃取法檢測到的成分多11種，這11種成分主要是八碳以上的脂肪酸，這些脂肪酸大多沸點較高，無法通過蒸餾的方式從糟醅中餾出。

圖2 三種方法提取各類物質(zhì)相對百分含量比較Fig.2 Comparison of various compounds extraction with the three methods

3種方法各類物質(zhì)相對百分含量比較結(jié)果見圖2（醇類物質(zhì)不包含乙醇）。由圖2可知，酒醅中含量較高的成分主要是醇、酸、酯三類成分，超聲輔助溶劑萃取法測得的酸類成分相對含量高于其余兩種方法，而蒸餾-微溶劑萃取法測得的酯類含量高于其余兩種方法。

3 結(jié)論

分別采用水蒸氣蒸餾（SD）法、超聲輔助溶劑萃?。║ASE）法和蒸餾-微溶劑萃?。⊿D-MSE）法從濃香型白酒酒醅中提取揮發(fā)性成分，利用峰面積歸一化法測定各成分的相對百分含量，通過對揮發(fā)性成分的氣相色譜-質(zhì)譜連用/自動化退卷積系統(tǒng)（GC-MS/AMDIS）對比分析。SD鑒定出42種成分，UASE 71種，SD-MSE 60種。 SD測得的醇（不包含乙醇，下同）、酸、酯的相對含量分別為1.34%，6.61%，21.67%；UASE的醇、酸、酯含量分別為1.03%，39.28%，37.42%；SD-MSE 3.96%，9.97%，64.97%。由此可知，SD對酸、酯的提取效果劣于另兩種方法，UASE對酸類物質(zhì)萃取效果更佳，SD-MSE對酯類物質(zhì)的萃取效果更佳。和UASE相比，SD-MSE節(jié)約了大量溶劑，減少了樣品轉(zhuǎn)移次數(shù)，且待測液澄清透明，是一種適宜萃取糟醅中低沸點成分的方法。

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A method of extraction of the lower boiling volatile compounds from fermented grains

GUO Jiaxiu1,ZHANG suyi2,3,ZHAO Jinsong1,3,4,WU Weiyu4,SU Zhanyuan4,YANG Jiangang1*
（1.School of Biological Engineering,Sichuan University of Science and Engineering,Zigong 643000,China;2.Luzhou Laojiao Co.,Ltd.,Luzhou 646000,China;3.National Research Center of Solid State Brewing Engineering Technology,Luzhou 646000,China;4.National Quality Supervision and Inspection Center for Alcoholic Products,Luzhou 646000,China）

Steam distillation （SD）,ultrasonic assisted solvent extraction （UASE）and steam distillation-microsolvent extraction （SD-MSE）were used to extract volatile components from fermented grains,and the relative contents of volatile components were determined by peak area normalization method and analyzed by gas chromatography-mass spectrometry/automated mass spectral deconvolution&identification system （GC-MS/AMDIS）.The results showed that 42,71 and 60 kinds of volatile components were identified by SD,UASE and SD-MSE method,respectively.The relative contents of alcohols,acids and esters were 1.34%,6.61%,21.67%;1.03%,39.28%,37.42%;3.96%,9.97%,64.97%by SD,UASE and SD-MSE method,respectively.It could be concluded that the extraction effect of SD method on acids and esters was inferior to the other two methods,UASE method had better extraction effect on acids,and SD-MSE method had better extraction effect on esters.Compared with UASE method,SD-MSE could save a large amount of solvent,reduce the number of times for samples transfer,and the sample was clear and transparent,which was a kind of method suitable for extraction of low boiling volatile components in fermented grains.

steam distillation method;ultrasonic assisted solvent extraction method;steam distillation-microextraction method;gas chromatographymass spectrometry/automated mass spectral deconvolution&identification system

TQ920.6

0254-5071（2017）12-0144-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.030

2017-09-03

釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室（NJ201501）；固態(tài)釀造研究院士（專家）工作站開放基金（GY2015-03）；四川省省屬高校科研創(chuàng)新團隊建設(shè)計劃（16TD026）

郭家秀（1992-），碩士研究生，研究方向為釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用。

*通訊作者：楊建剛（1961-），教授，博士，研究方向為食品發(fā)酵與釀造技術(shù)。