羅漢果內(nèi)生真菌的分離及其發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性研究

范彩琴，張昌志，龍楚媚，付 強，趙豐麗，*，宋云飛，楊文國

（1.廣西師范大學 生命科學學院，廣西 桂林 541006；2.桂林萊茵生物科技股份有限公司，廣西 桂林 541199）

羅漢果內(nèi)生真菌的分離及其發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性研究

范彩琴1，張昌志1，龍楚媚1，付 強1，趙豐麗1，2*，宋云飛2，楊文國2

（1.廣西師范大學 生命科學學院，廣西 桂林 541006；2.桂林萊茵生物科技股份有限公司，廣西 桂林 541199）

為探究羅漢果內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的化學成分及其抗氧化活性，從羅漢果內(nèi)生真菌中篩選8株菌株的代謝產(chǎn)物進行化學成分試驗，用DPPH·清除法和·OH清除法測定發(fā)酵產(chǎn)物的體外抗氧化活性。結(jié)果表明，8株羅漢果內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物通過化學成分定性試驗，推測可能含有蛋白質(zhì)、多糖、有機酸、黃酮和醌類等物質(zhì)。在供試液質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，其中菌株F5發(fā)酵液對DPPH·的清除率大小順序為乙酸乙酯萃取相（96.83%）＞VC（95.77%）＞氯仿相（95.24%）；菌株F5發(fā)酵液對·OH的清除率大小順序為VC（99.36%）＞原液（73.56%）＞水相（61.98%），表明羅漢果內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物具有較強的抗氧化作用，并且抗氧化的成分極性較大。

羅漢果；內(nèi)生真菌；發(fā)酵產(chǎn)物；抗氧化活性

羅漢果（Siraitia grosvenorii）是我國傳統(tǒng)的藥食兩用植物，主要分布在我國廣東、廣西、湖南、云南、貴州等地。據(jù)報道，羅漢果果實中的甜苷[1-3]、多糖[4]、黃酮[5]等都具有很好的抗氧化活性。從羅漢果中尋找天然抗氧化物質(zhì)也一直是科研工作者研究的熱點，但羅漢果對種植環(huán)境要求苛刻，適栽區(qū)Ⅱ狹窄，生長周期長，這給天然抗氧化活性物質(zhì)的大量生產(chǎn)帶來很大困難。內(nèi)生真菌是指生活在健康動植物的組織、器官內(nèi)部細胞內(nèi)或細胞間隙的一類微生物，在長期的進化過程中和宿主形成了互惠互利、相互制約的共生關(guān)系[6]。研究發(fā)現(xiàn)，特殊生態(tài)環(huán)境下的微生物能夠產(chǎn)生特殊的次生代謝產(chǎn)物，內(nèi)生真菌存在于植物體內(nèi)的特殊生長環(huán)境，已被證實具有合成和宿主植物相同或相似活性成分的能力[7]。這表明內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生具有抗氧化活性的代謝產(chǎn)物，同時也是抗氧化活性物質(zhì)的重要來源。目前，在醫(yī)療和食品領(lǐng)Ⅱ使用較多的是合成抗氧劑，而動物試驗研究結(jié)果表明，合成抗氧劑（如丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）、丁基羥基茴香醚（butylated hydroxyanisole，BHA）等）對生物體有潛在的毒副作用[8]。因此，從動植物資源中尋找天然、安全的抗氧化劑逐漸成為研究熱點。為了更好地開發(fā)利用羅漢果內(nèi)生真菌，本研究通過對實驗室分離的羅漢果內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物進行化學成分預試驗，初步推斷出其化學成分，采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基[9]和羥基自由基（·OH）清除法，對羅漢果內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物不同極性溶劑萃取相進行抗氧化活性及部位進行研究，以期為羅漢果內(nèi)生菌的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

菌種：羅漢果于2015年10月采自廣西桂林龍勝縣，菌株F1～F8內(nèi)生真菌分離自健康羅漢果。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：稱取已去皮馬鈴薯200 g，切塊，煮30 min，四層紗布過濾，加入蔗糖20 g，瓊脂20 g，自來水定容1 000 mL，pH自然，121℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基[10]：葡萄糖20 g/L，蛋白胨2.5 g/L，酵母浸膏2.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH值7.0，121℃滅菌30 min。

1.1.3 化學試劑

DPPH（分析純）：天津凱瑪科技有限公司；H2O2、次氯酸鈉（NaClO）、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、無水乙醇（均為分析純）：西隴化工股份有限公司；維生素C（vitamin C，VC）、水楊酸（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠；硫酸亞鐵（分析純）：天津市福晨化學試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

SY100型顯微鏡：日本Nikon公司；BXM-30R型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HZ200LB型恒溫搖床、HP400S型生化培養(yǎng)箱：武漢瑞華儀器設(shè)備有限責任公司；UV mini-1240型紫外分光光度計：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 羅漢果內(nèi)生真菌的分離純化

在超凈工作臺上，將洗凈的羅漢果用體積分數(shù)為75%酒精浸泡1 min，無菌水沖洗1次；再用次氯酸鈉（NaClO）浸泡5 min，無菌水沖洗1次；最后用體積分數(shù)為75%的酒精浸泡30 s，無菌水沖洗3次，并吸取1 mL第3次沖洗的無菌水涂布于培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，作為陰性對照[11]。將已消毒的羅漢果接種到PDA培養(yǎng)基上，26℃培養(yǎng)，定期觀察生長情況，待組織周圍長出菌落，進行分離純化得到羅漢果果實的內(nèi)生真菌。

1.3.2 內(nèi)生真菌的發(fā)酵及產(chǎn)物提取

將活化好的內(nèi)生菌株接種到裝液量200 mL/500 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、160 r/min條件下?lián)u床發(fā)酵7 d。發(fā)酵完成后，減壓抽濾分離菌絲體，濾液減壓濃縮成浸膏。菌絲體50 ℃烘干，粉碎，料液比1∶10（g∶mL），超聲波（350W，45kHz）輔助提取30 min，提取3次，抽濾合并提取液，減壓濃縮成浸膏[12-13]，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物化學成分定性試驗

將內(nèi)生真菌發(fā)酵液減壓濃縮得到的浸膏和菌絲體水提液濃縮的浸膏，分別加蒸餾水制備成水提液、加體積分數(shù)為75%的酒精制備成醇提液和加蒸餾水混懸用石油醚萃取得石油醚提取液。采用試管法、顏色反應(yīng)和圓形濾紙法等方法對不同提取液進行化學成分鑒定系統(tǒng)定性試驗，具體實驗方法參見文獻[14]。

1.3.4 抗氧化活性菌株初步篩選

稱取一定質(zhì)量的發(fā)酵液浸膏和菌絲體浸膏，用無水乙醇配成1 mg/mL的待測液，對羅漢果內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物進行DPPH·清除能力測定，篩選出對DPPH·清除能力強的菌株做進一步抗氧化活性部位的追蹤。

1.3.5 抗氧化活性部位的追蹤

為進一步研究活性菌株發(fā)酵產(chǎn)物中抗氧化活性部位，將篩選得到的活性菌株發(fā)酵液浸膏和菌絲體浸膏用蒸餾水混懸，依次用石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取3次[15]，合并萃取液，得到石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相和剩余水相，減壓濃縮至浸膏。稱取一定質(zhì)量的各萃取相浸膏，用無水乙醇配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的待測液，分別進行DPPH·清除能力測定，研究活性菌株發(fā)酵產(chǎn)物中抗氧化活性部位。定

1.3.6 DPPH·清除能力測定

參照張新國等[16]的方法有所改動：吸取1.0 mL待測液，加入0.15 mmol/L DPPH·乙醇溶液1.0 mL，搖勻后置于黑暗處室溫反應(yīng)30 min，以無水乙醇調(diào)零，在波長517 nm處測定吸光度值A(chǔ)1，用無水乙醇代替DPPH·所測值為吸光度值A(chǔ)2，用無水乙醇代替待測液所測值為吸光度值A(chǔ)0，同時與抗氧化陽性對照1 mg/mL維生素C（VC）溶液對DPPH·清除能力進行比較。每個試驗重復3次，試驗數(shù)據(jù)處理采用Q值檢測[17]。DPPH·清除率計算公式如下：

1.3.7 ·OH清除能力的測定

參照SMIRNOFF N等[17]的方法有所改動：試管中依次加入1.0 mL樣品提取液，9 mmol/L的硫酸亞鐵1.0 mL，9 mol/L的H2O2溶液1.0 mL，靜置10 min，再加入9.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1.0 mL，混合均勻，靜置30 min，在波長510 nm處測定吸光度值A(chǔ)1，用蒸餾水代替水楊酸測得吸光度值A(chǔ)2，蒸餾水代替待測液測得吸光度值為A0，同時與1 mg/mL VC溶液對·OH清除能力進行比較。每個試驗重復3次，試驗數(shù)據(jù)處理采用Q值檢測[17]?！H清除率計算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌分離純化結(jié)果

羅漢果經(jīng)過消毒處理后接種于PDA培養(yǎng)基，2d后組織周圍開始出現(xiàn)菌落，而對照組培養(yǎng)基中未發(fā)現(xiàn)菌落生長，說明羅漢果表面沒有雜菌，本試驗選擇表面消毒劑的濃度和消毒時間比較合適。羅漢果內(nèi)生真菌經(jīng)分離純化，共得到12株內(nèi)生真菌。挑選菌株生長速度快且健壯的8株內(nèi)生真菌株進行發(fā)酵。 菌株依次編號為F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8，如圖1所示。

圖1 8株內(nèi)生真菌菌落形態(tài)Fig.1 Colonial morphology of 8 strains of endophytic fungi

2.2 內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物化學成分定性試驗結(jié)果

對這8株內(nèi)生真菌發(fā)酵液浸膏和菌絲體浸膏的乙醇提取液、水提液和石油醚提取液的化學成分進行定性試驗，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，初步推斷出這8株羅漢果內(nèi)生真菌無論是發(fā)酵液中還是菌絲體中大部分都含有蛋白質(zhì)、多糖、有機酸、黃酮和醌類等化學成分，其中菌株F8發(fā)酵液中的泡沫實驗表明含有皂苷，碘化鉍鉀有淡黃色沉淀和改良的碘化鉍鉀-碘-碘化鉀有棕色斑點，表明含有生物堿類化學成分。說明羅漢果內(nèi)生菌中含有多種活性成分，值得開發(fā)利用。

表1 8株內(nèi)生菌發(fā)酵液與菌絲體化學成分系統(tǒng)預試驗結(jié)果Table 1 Experimental results of chemical compositions of fermentation broth and mycelial of 8 endophytic strains

2.3 抗氧化活性菌株初步篩選

8株內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對DPPH·清除率試驗結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，與陽性對照VC相比，試驗的8株菌株無論是發(fā)酵液還是菌絲體提取物均對DPPH·具有清除作用，但清除能力不同。在供試液質(zhì)量濃度為1mg/mL時，其中菌株F5無論菌絲體浸膏還是發(fā)酵液浸膏提取物都對DPPH·具有較強的清除作用，分別是94.09%和93.56%，剩余7株菌株發(fā)酵液提取物對DPPH·的清除率分別是93.54%、67.67%、94.71%、86.65%、92.81%、93.53%、73.63%，菌絲體提取物對DPPH·的清除率分別是87.43%、91.77%、94.61%、89.52%、87.87%、42.30%、96.57%。綜合考慮，選擇兩者對DPPH·均有較強清除作用的菌株F5進行菌株抗氧化活性部位的篩選。

圖2 8株內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對DPPH·的清除率Fig．2 Clearance rate of fermentation products of 8 strains of endophytic fungi on DPPH·

2.4 菌株F5發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性部位篩選

采用DPPH·清除法和·OH清除法測定菌株F5發(fā)酵液浸膏和菌絲體浸膏兩者的原液、石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相和水相的抗氧化活性，結(jié)果如圖3所示。由圖3（a）可知，當菌株F5發(fā)酵液浸膏的質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，原液、石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相和水相對DPPH·的清除率分別是94.09%%、90.48%、95.24%、96.83%、39.80%。菌株F5菌絲體浸膏質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，5個相對DPPH·的清除率分別是93.56%、26.46%、66.67%、78.84%、78.11%。陽性對照VC（1 mg/mL）對DPPH·的清除率為95.77%，菌株F5發(fā)酵液和菌絲體浸膏各個相對DPPH·的清除率小于1 mg/mL VC的清除率。結(jié)果表明，抗氧化活性最大的部位是發(fā)酵液浸膏的乙酸乙酯相，而菌絲體浸膏最大的是乙酸乙酯相和水相。說明具有抗氧化作用的成分極性較大。

由圖3（b）可知，當菌株F5發(fā)酵液浸膏的質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，菌株F5發(fā)酵原液、石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相和水相對·OH清除率分別是73.56%、25.17%、25.56%、26.20%、61.98%。菌株F5菌絲體浸膏質(zhì)量濃度為1mg/mL時，菌株F5菌絲體5個相對·OH清除率分別是71.25%、12.78%、35.14%、54.25%、52.09%。菌株F5發(fā)酵液浸膏和菌絲體浸膏各個相對·OH清除率＜1 mg/mL VC的清除率（99.36%），結(jié)果表明，無論是發(fā)酵液浸膏還是菌絲體浸膏的水相和乙酸乙酯相具有較強的抗氧化作用，說明抗氧化的成分極性較大。

綜合菌株F5發(fā)酵液浸膏和菌絲體浸膏各萃取相對DPPH·和·OH的清除作用結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，總體上對DPPH·的清除作用較強，對·OH的清除作用較弱，表1中菌株F5化學成分預實驗結(jié)果顯示含有多糖、黃酮、蒽醌等成分，結(jié)合現(xiàn)在已經(jīng)研究證實的抗氧化成分[2-5]，推斷具有抗氧化作用的成分可能是多糖、黃酮、蒽醌等，但這有待于進一步的研究。

圖3 菌株F5發(fā)酵產(chǎn)物不同相萃取物對DPPH·（a）及·OH（b）的清除率Fig．3 Clearance rates of different phase extracts of fermentation products of strain F5on DPPH·（a）and·OH（b）

3 結(jié)論

從羅漢果中分離純化得到了12株羅漢果內(nèi)生真菌，從中篩選出8株進行發(fā)酵產(chǎn)物化學成分預試驗及抗氧化能力測定，初步鑒定出這8株羅漢果內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物大部分都含有蛋白質(zhì)、多糖、有機酸、黃酮、醌類等化學成分。對8株內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵液和菌絲體進行DPPH·清除能力的測定，發(fā)現(xiàn)8株內(nèi)生真菌都表現(xiàn)出良好的DPPH·清除能力。對DPPH·清除率越大，發(fā)酵產(chǎn)物中多糖、黃酮、皂苷等抗氧化活性成分含量也會相對較高。而從羅漢果中提取的多酚、多糖、黃酮和皂苷類等成分已被證實具有良好的抗氧化活性[1-6]。這也證實了植物內(nèi)生真菌一般能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的生理活性物質(zhì)。

結(jié)果表明，菌株F5發(fā)酵液對DPPH·的清除率大小順序為乙酸乙酯萃取相（96.83%）＞VC（95.77%）＞氯仿相（95.24%）；菌株F5發(fā)酵液對·OH的清除率大小順序為VC（99.36%）＞原液（73.56%）＞水相（61.98%），表明羅漢果內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物具有較強的抗氧化作用，并且抗氧化的成分極性較大，這為進一步研究羅漢果內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物中的抗氧化活性成分奠定基礎(chǔ)。

[1]TSURTEMATSU T,SHIGENOBU A.Study on the constituents from fruits ofMommordicae grosvenori[J].J Pharm （Japan）,1983,103（2）:1151-1173.

[2]劉 兆，榮永海，王志濱，等.閃提技術(shù)提取羅漢果甜甙[J].天然產(chǎn)物與開發(fā)，2011，23（3）：561-564.

[3]趙 燕，劉國艷，史賢明.羅漢果水提取物及其甜甙的體內(nèi)抗氧化作用[J].食品研究與開發(fā)，2012，33（2）：174-176.

[4]陳 瑤，賈恩禮.羅漢果化學成分和藥理作用的研究進展[J].解放軍藥學學報，2011，27（2）：171-174.

[5]張貴會，王 賀，楊 玲.新疆藥桑葉中黃酮類化合物的分離及其抗氧化活性評價[J].中國釀造，2016，35（2）：101-105.

[6]肖 剛，王 勤.羅漢果甜苷保肝作用實驗研究[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（2）：196-200.

[7]KLEOPPE J W,SCHIPPER B,BAKKER P.Proposed elimination of the term endorhizosphere[J].Phytopatholology,1992,82（3）:726-727.

[8]LAURA F A,PILAR D V,DOLORES D A,et al.Binary combinations of BHA and other natural and synthetic phenolics:antimicrobial activity againstStaphylococcus aureusand antioxidant capacity[J].Food Control,2014,42:303-309.

[9]徐盼菊，孟凡欣，唐 萌，等.黑虎掌菌粗多糖制備及體外抗氧化活性研究[J].中國釀造，2017，36（3）：150-155.

[10]付東興.羅漢果塊根內(nèi)生真菌及其次級代謝產(chǎn)物的研究[D].南寧：廣西大學，2012.

[11]陳海燕，付東興，林翠梧，等.羅漢果內(nèi)生真菌SG-69次級代謝產(chǎn)物的研究[J].應(yīng)用化工，2012，41（8）：1318-1320.

[12]楊海濤，曹小燕.酶-超聲輔助提取苦蕎稈中總黃酮及抗氧化活性研究[J].中國釀造，2016，35（9）：72-76.

[13]劉海鷗，虎春艷，趙聲蘭，等.滇黃芩總黃酮酶解超聲提取工藝及抗氧化活性研究[J].中國釀造，2016，35（1）：110-114.

[14]張 寧.棘豆波絲菌發(fā)酵產(chǎn)物化學成分及藥理作用的研究[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學，2011.

[15]潘 峰，蘇天驕，鄧克莉，等.川貝母內(nèi)生真菌Fusarium tricinctum CBY11 抗氧化活性及代謝成分研究[J].菌物學報，2017，36（6）：752-765.

[16]張新國，唐 鵬，劉英娟，等.6種藥用植物內(nèi)生菌提取物的抗氧化活性研究[J].現(xiàn)代食品科技，2016，32（4）：66-74.

[17]SMIRNOFF N,CUMBES Q J.Hydroxyl radical scavenging activity of compatible solutes[J].Phytochemistry,1989,28（4）:1057-1060.

Separation of endophytic fungi ofSiraitia grosvenoriiand antioxidant activity of fermentation products

FAN Caiqin1,ZHANG Changzhi1,LONG Chumei1,FU Qiang1,ZHAO Fengli1,2*,SONG Yunfei2,YANG Wenguo2
（1.College of Life Science,Guangxi Normal University,Guilin 541006,China;2.Guilin Layn Biotechnology Co.,Ltd.,Guilin 541199,China）

To explore the chemical composition of fermentation products of endophytic fungi ofSiraitia grosvenoriiand its antioxidant activity,8 strains from endophytic fungi ofS.grosvenoriiof metabolites system was screened,to conduct preliminary experiments on chemical composition tests,and then thein vitroantioxidant activity of fermentation products was determined by DPPH·and·OH clearance methods.The results showed that the chemical compositions of fermentation products of 8 endophytic fungi fromS.grosvenoriiwas qualitatively tested,and it showed that it may contain protein,polysaccharide,organic acids,flavonoid,anthraquinone and other substances.When the concentration of test liquid was 1 mg/ml,the fermentation broth of strain F5had good antioxidant activity,and the clearance rate of ethyl acetate extract phase （96.83%）on·DPPH was higher than VC（95.77%）and chloroform phase （95.24%）.While the clearance rate on·OH in order was VC （99.36%）,fermentation broth （73.56%）,and water phase （61.98%）.The results showed that the fermentation products of endophytic fungi ofS.grosvenoriihad strong antioxidant activity,and the polarity of the antioxidant ingredients was larger.

Siraitia grosvenorii;endophytic fungi;fermentation products;antioxidant activity

Q939.9

0254-5071（2017）12-0046-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.010

2017-10-17

桂林市科學研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目（2016010304-2，20171015-2）

范彩琴（1992-），女，碩士研究生，研究方向為生物化學與分子生物學。

*通訊作者：趙豐麗（1961-），女，教授，碩士，研究方向為功能性食品、發(fā)酵工程及生物活性成分。