趨化因子SDF-1促進基于內(nèi)源性干細(xì)胞歸巢的初步研究

黃曉 陳暉 劉玉健 汪俊

趨化因子SDF-1促進基于內(nèi)源性干細(xì)胞歸巢的初步研究

黃曉 陳暉 劉玉健 汪俊

目的 通過體內(nèi)、外實驗，研究基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（Stromal cell–derived factor-1，SDF1）對細(xì)胞的趨化作用。方法 體外培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）。通過Transwell實驗，檢測不同濃度SDF1對BMSC體外趨化作用的影響。采用MTT法，檢測不同濃度SDF1對BMSC細(xì)胞活性的影響。通過將負(fù)載SDF1的無紡聚羥基乙酸植入裸鼠皮下，檢測SDF1的體內(nèi)趨化活性。結(jié)果 10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL SDF1組體外趨化BMSC數(shù)目均較對照組增加，其中100 ng/mL SDF1組趨化細(xì)胞數(shù)目最高。10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL SDF1對BMSC細(xì)胞活性無影響，200 ng/mL SDF1可降低BMSC細(xì)胞活性。100 ng/mL SDF1可促進體內(nèi)細(xì)胞募集。結(jié)論100 ng/mL SDF1可有效促進細(xì)胞趨化且對細(xì)胞活性無影響。

基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 干細(xì)胞募集 趨化作用

全脫位牙外傷是青少年最常見的牙外傷之一，最常累及的人群是8～9歲的兒童[1]。目前，牙再植是治療全脫位牙外傷的主要方法[2-3]。但是，全脫位牙再植，尤其是延時再植后，患牙牙根常發(fā)生替代性吸收，最終導(dǎo)致患牙喪失[4-5]。由于全脫位最常累及的牙位為上頜中切牙，因此牙再植的失敗不僅嚴(yán)重影響患兒牙頜系統(tǒng)的發(fā)育，也會對患兒的發(fā)音、美觀及心理等產(chǎn)生不良影響，提高牙再植的成功率一直是兒童牙科面臨的一大挑戰(zhàn)。

牙根替代吸收是牙再植失敗最主要的原因，其根源在于患牙根面缺乏足夠的活性牙周膜細(xì)胞。此時相鄰骨髓腔內(nèi)骨內(nèi)膜細(xì)胞異常增生，分化出破牙細(xì)胞，競爭性附著到牙根面，導(dǎo)致牙根發(fā)生替代性吸收，最終導(dǎo)致患牙喪失[6]。因此，有效促進再植牙牙周組織的再生，恢復(fù)牙周組織的正常結(jié)構(gòu)和功能是全脫位牙延時再植成功的關(guān)鍵。相關(guān)研究已證實，根面細(xì)胞移植可明顯改善全脫位牙再植的預(yù)后[7-10]。但細(xì)胞移植存在諸多缺點，如細(xì)胞來源難以解決，細(xì)胞培養(yǎng)操作復(fù)雜，費用高，耗時長，難以進行臨床轉(zhuǎn)化等[11-12]。因此，尋找新的、易于臨床轉(zhuǎn)化的、能夠促進再植牙牙周組織再生的方法勢在必行。

隨著組織工程和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)人體的多種組織中均存在內(nèi)源性前體/干細(xì)胞，通過誘導(dǎo)內(nèi)源性干細(xì)胞歸巢也可以促進組織再生修復(fù)[13-14]。這種基于干細(xì)胞歸巢的內(nèi)源性再生技術(shù)已成為一種新的理念，并在多個醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了證實。但該理念是否有助于全脫牙再植時牙周膜的再生、提高再植成功率，目前尚無報道。該理念的關(guān)鍵在于有效地募集內(nèi)源性干細(xì)胞歸巢，以最大限度地獲得再生細(xì)胞來源[15-16]。目前，促進內(nèi)源性干細(xì)胞向靶位點歸巢最經(jīng)典的方法就是通過趨化因子募集。趨化因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（Stromal cell derived factor-1，SDF-1）是CXC類趨化因子，通過與CXCR4受體結(jié)合被激活[16-17]。大量研究顯示，損傷部位上調(diào)的SDF-1可有效募集循環(huán)系統(tǒng)或損傷部位留存的CXCR4+間充質(zhì)細(xì)胞及前體細(xì)胞到達(dá)損傷部位，修復(fù)受損組織[18-20]。全脫位后牙周組織被破壞，牙周組織再生的前體/干細(xì)胞來源主要是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 （Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）[4，14]，為 CXCR4+干細(xì)胞[18]。因此，本研究擬通過體內(nèi)、外實驗，驗證SDF-1對于BMSCs趨化作用的影響，為將其用于全脫位牙再植的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4周齡雌性未孕SD大鼠及6周齡雌性裸鼠（上海斯萊克實驗動物有限公司），飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院SPF動物房，動物使用許可證號SCXK（滬）2012-0007。本實驗對動物的處理方法符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的 《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 主要材料及試劑

DMEM培養(yǎng)液（HyClone，美國），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），青霉素鏈霉素（Gibco，美國），胰蛋白酶（HyClone，美國），PBS、4%多聚甲醛（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），重組人基質(zhì)細(xì)胞衍生因子 （Peprotech，美國），MTT試劑盒（Sigma，美國）。

超凈工作臺 （蘇凈集團），CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific，美國），倒置相差顯微鏡（Olympus，日本），Transwell（Corning，美國），恒溫水浴箱（Shellab，美國），高速離心機（Eppendorf，德國），震蕩儀（躍進儀器廠），Human Reader 酶標(biāo)儀（Human，德國）。

1.3 BMSCs的分離、培養(yǎng)和純化

采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs。取4周齡雌性未孕SD大鼠股骨及脛骨，以5 mL注射器吸取DMEM培養(yǎng)液，將骨髓沖至離心管內(nèi)，1 500 r/min離心10 min，棄上清，采用DMEM完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素）重懸細(xì)胞，選用10 cm培養(yǎng)皿，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，5 d后換液去除未貼壁細(xì)胞。以后每3天換液，逐步去除未貼壁紅細(xì)胞，待細(xì)胞長至80%～90%融合時傳代培養(yǎng)。選用第3代BMSCs進行實驗。

1.4 Transwell體外趨化實驗

以 24孔板 Transwell（8 μm 聚碳酸酯膜）行體外趨化實驗。將BMSCs用胰酶消化，細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)后將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105cells/mL，向小室的上室中加入細(xì)胞懸液200 μL，下室分別加入含不同種濃度 SDF1 （10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL）的 DMEM 培養(yǎng)液 700 μL；對照組為不含 SDF1的DMEM培養(yǎng)液。每組設(shè)2個復(fù)孔。將Transwell放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 h，取出 Transwell，棄掉上室培養(yǎng)液，PBS洗2遍，用棉簽將聚碳酸酯膜上細(xì)胞擦掉，4%多聚甲醛固定20 min，PBS沖洗2遍，蘇木精染色30 min，流水沖洗15 min，倒置相差顯微鏡下觀察拍照，每個復(fù)孔隨機選取5個視野進行計數(shù)統(tǒng)計。

1.5 MTT檢測細(xì)胞活性

將第3代BMSCs用胰酶消化、重懸、計數(shù)，以2×104cells/mL的密度接種入96孔板，每孔200 μL，每組設(shè)5個復(fù)孔。培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，棄去原培養(yǎng)液，分別加入含不同種濃度SDF1的DMEM培養(yǎng)液（對照組、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL）。將96孔板于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于第1、4、7天取出一塊96孔板，每孔加入20 μL MTT，放入培養(yǎng)箱避光孵育4 h，取出培養(yǎng)板，吸掉培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），震蕩儀震蕩10 min，使用酶標(biāo)儀測定490 nm波長下的吸光度。以時間為橫軸，相對MTT值為縱軸，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.6 體內(nèi)趨化實驗

1.6.1 制備負(fù)載趨化因子的PLGA材料

15 mg無紡聚羥基乙酸（PLGA）纖維均勻放入圓柱狀硅膠模具（直徑4 mm，高2 mm）內(nèi)，過夜后取出，將0.1%的聚乳酸（PLA）溶液均勻滴至PLGA內(nèi)，自然風(fēng)干后，用75%乙醇消毒30 min，PBS沖洗3遍，吸干，紫外線消毒2 h后無菌儲存?zhèn)溆谩?/p>

配制100 ng/mL的SDF1膠原溶液 （Ⅰ型膠原的濃度為2 mg/mL）。將實驗組的PLGA材料浸泡于含SDF1的膠原溶液中10 min，對照組PLGA材料浸泡于不含SDF1因子的膠原溶液中10 min。

1.6.2 因子/PLGA材料復(fù)合物回植

裸鼠皮膚消毒，將各組的因子/PLGA材料復(fù)合物接種至裸鼠右側(cè)背部皮下，每組3只。

1.6.3 樣本組織學(xué)分析

分別于回植1周、2周后取材，4%多聚甲醛固定24 h，將標(biāo)本流水沖洗 30 min，50%、75%、85%、90%、95%、100%乙醇梯度脫水，二甲苯浸泡30 min，石蠟包埋、切片（厚度4 μm），HE染色。光學(xué)顯微鏡觀察，每組切片隨機選取5個視野拍照，細(xì)胞計數(shù)統(tǒng)計。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS16.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SDF1促進BMSCs募集

Transwell實驗檢測不同濃度SDF1對BMSCs趨化作用的影響。結(jié)果顯示：與對照組相比，10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL SDF1 組趨化細(xì)胞數(shù)目均顯著增加（P＜0.05），其中 100 ng/mL SDF1 組趨化細(xì)胞數(shù)目最多。表明SDF1可促進BMSCs募集，SDF1濃度為100 ng/mL時具有最佳的趨化效應(yīng)（圖 1）。

圖1 不同濃度SDF1對BMSCs的趨化作用（*：P＜0.05，n=3）Fig.1 The chemotaxis of SDF1 with different concentration on BMSCs(*:P＜0.05,n=3)

2.2 SDF-1對BMSCs細(xì)胞活力的影響

MTT實驗檢測不同濃度SDF1作用下BMSCs細(xì)胞活性的改變。結(jié)果顯示，10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL SDF1組在第1、4、7天時細(xì)胞活性與對照組均無顯著差別（P＞0.05），而 200 ng/mL SDF1 組在第 1、4、7 天時細(xì)胞活性均較對照組下降（P＜0.05）。由此可見，SDF1濃度≤100 ng/mL時，對BMSCs細(xì)胞活力無影響（圖2）。

圖2 不同濃度SDF1對BMSCs細(xì)胞活性的影響（*：P＜0.05，n=6）Fig.2 The influences of SDF1 with different concentrations on cell viability of BMSCs(*:P＜0.05,n=6)

2.3 SDF-1促進體內(nèi)干細(xì)胞募集

基于上述體外實驗的結(jié)果，我們以100 ng/mL的SDF1進行后續(xù)的體內(nèi)趨化和組織再生實驗。通過膠原溶液將SDF1負(fù)載至PLGA支架內(nèi)，并以單純膠原溶液負(fù)載PLGA支架作為對照，將兩組材料植入裸鼠皮下。再植1周時，HE染色示SDF1組內(nèi)細(xì)胞數(shù)多于對照組；2周時的結(jié)果與1周時基本一致。說明SDF1可促進體內(nèi)細(xì)胞募集（圖3）。

圖3 負(fù)載SDF1的PLGA支架材料與對照組接種裸鼠1周及2周后的HE染色Fig.3 The HE staining of the SDF1-loaded PLGA and the control PLGA after implanted for 1 week and 2 weeks

3 討論

青少年兒童全脫位牙外傷主要累及中切牙，目前牙再植仍然是治療全脫位牙外傷的主要方法[1，3]。然而，由于受到各種條件的限制，患兒就診時，牙脫位時間基本都較長，通?；佳酪参词艿搅己玫谋Ｗo。當(dāng)患牙脫離牙槽窩時間過長，又未能妥善保存，根面牙周膜細(xì)胞會受環(huán)境（如干燥）、營養(yǎng)缺乏等不良因素影響，而導(dǎo)致喪失活性或死亡。牙再植后常由于患牙周圍缺少具有活性的細(xì)胞，導(dǎo)致破牙細(xì)胞競爭性附著到牙根面、牙根，發(fā)生替代性吸收，最終使得牙再植失敗[15]。因此，防治牙根發(fā)生替代性吸收是提高牙再植成功率的關(guān)鍵，而其重點在于增加患牙周圍的活細(xì)胞數(shù)目。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，通過募集干細(xì)胞/前體細(xì)胞至指定區(qū)域，可以實現(xiàn)組織再生的目的。目前，該技術(shù)能否應(yīng)用于全脫位牙再植仍不明了。該技術(shù)的關(guān)鍵在于募集足夠的干細(xì)胞/前體細(xì)胞，最常用的方法為趨化因子募集法[14]。

趨化因子是能使細(xì)胞發(fā)生趨化作用的細(xì)胞因子的總稱，目前有50多種，是一類分子量為8～10 Kda的小分子量蛋白質(zhì)，分為CXC、CC、C和CX3C四大亞家族[21]。SDF-1是應(yīng)用最廣泛的一類趨化因子，屬于CXC類家族，系統(tǒng)命名為CXCL12。SDF1通過與特異性且唯一性受體CXCR4結(jié)合，激活受體偶聯(lián)蛋白，并進一步激活下游途徑。研究顯示，損傷部位上調(diào)的SDF1可有效募集循環(huán)系統(tǒng)或損傷部位留存的CXCR4+間充質(zhì)細(xì)胞及前體細(xì)胞到達(dá)損傷部位，修復(fù)受損的組織[9－10，18，22]。 另外，口腔領(lǐng)域的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在炎癥性牙髓組織中，SDF1-CXCR4軸存在于微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，并在微血管的周圍分布著大量的牙髓細(xì)胞，SDF1-CXCR4軸可有效募集牙髓干細(xì)胞從干細(xì)胞巢到達(dá)損傷區(qū)域，參與牙髓組織的再生[21]。研究已經(jīng)證實了BMSC在牙周組織的再生中發(fā)揮著重要作用，且BMSC為CXCR4+間充質(zhì)干細(xì)胞[18，23－24]。 本研究的體外實驗證實，10～200 ng/mL 濃度的SDF1均對BMSC有趨化作用，其中SDF1濃度在100 ng/mL時趨化的細(xì)胞最多，表明該濃度下SDF1具有較強的趨化效應(yīng)。同時，通過細(xì)胞活性檢測發(fā)現(xiàn)，當(dāng)SDF1濃度在100 ng/mL及以下時對BMSCs活性無影響。因此，體內(nèi)實驗部分采用的SDF1濃度為100 ng/mL。在該濃度下，SDF1趨化作用較強的同時細(xì)胞毒性較小。當(dāng)將負(fù)載SDF1的PLGA材料植入裸鼠皮下后發(fā)現(xiàn)，SDF1可促進細(xì)胞的募集，這可能會進一步促進組織再生。上述實驗結(jié)果為SDF1應(yīng)用于牙周組織的再生奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究通過體外實驗證實100 ng/mL SDF1可有效促進BMSCs趨化，且對BMSCs活性無明顯抑制作用，體內(nèi)試驗表明100 ng/mL SDF1可促進細(xì)胞募集，這為SDF1應(yīng)用于基于干細(xì)胞歸巢的牙周組織再生奠定了基礎(chǔ)。然而，SDF1體內(nèi)趨化的是細(xì)胞種類，以及這些細(xì)胞在組織再生中發(fā)揮的功能等，尚需進一步探討。

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A Preliminary Study of SDF-1 in Stem Cell Homing-guided Tissue Regeneration

HUANG Xiao1,CHEN Hui2,LIU Yujian2,WANG Jun2．1 Department of Pediatric Dentistry,Shanghai Stomatological Hospital,Shanghai 200001,China;2 Department of Pediatric Dentistry,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Key Laboratory of Stomatology,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:WANG Jun (E-mail:wangjun202@126.com).

Objective To investigate the chemotaxis of stromal cell derived factor-1 (SDF1)in vitro and in vivo.Methods Bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)were cultivated from SD rats.Transwell test was used to evaluate the influences of different concentration of SDF1 on chemotaxis of BMSC.MTT test was used to analyze the effects of different concentration of SDF1 on the cell viability of BMSC.100 ng/mL SDF1-loaded PLGA was implanted in nude mice to study the the chemotaxis of SDF1 in vivo.Results All 4 groups of SDF1 (10 ng/mL,50 ng/mL,100 ng/mL and 200 ng/mL)recruited more BMSC than the control group,and 100 ng/mL SDF1 showed better results than the other groups.200 ng/mL SDF1 deceased cell viability of BMSC on day 1,4 and 7,while 10 ng/mL,50 ng/mL and 100 ng/mL SDF1 had no effects on the the viability of BMSC.In vivo analysis showed that 100 ng/mL SDF1 could promote cell recruitment.Conclusion 100 ng/mL SDF1 could effectively promote BMSC recruitment without influence on cell viability in vitro and 100 ng/mL SDF1 could promote cell homing in vivo.

Stromal cell derived factor-1;Bone marrow mesenchymal stem cells; Stem cell recruitment; Chemotaxis

Q813.1+1

A

1673－0364（2017）05－0287－05

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.05.013

200001 上海市 上海市口腔病防治院兒童口腔科（黃曉）；200011 上海市 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院兒童口腔科，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室（陳暉，劉玉健，汪?。?/p>

汪?。‥-mail：wangjun202@126.com）。

2017年7月16日；

2017年8月22日）