氯金酸修飾對再生電極檢測性能的影響

劉永玲 ,李 立,李文嬌,趙 勇,盧 瑛 ,4,5*

1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院,上海 201306

2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心;農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室,上海 201306

3.食品熱加工技術(shù)研究發(fā)展中心（亞洲）,上海 201306

4.食品科學(xué)與工程國家級實驗教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué)),上海201306

5.國家淡水水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心,上海201306

近年來，納米材料的電化學(xué)免疫傳感器以其快速、靈敏、可在線檢測等特點，在致病菌，抗生素殘留，農(nóng)、獸藥殘留和毒素檢測等方面已成為一種快速、方便、可靠的食品安全檢測方法[1,2]，并受到越來越多的關(guān)注和研究。但這些傳感器往往都是一次性的，大大影響了免疫傳感器在實際生產(chǎn)應(yīng)用中的競爭力，且增加了制作的難度和成本。因此尋找有效的傳感器再生方法可是很有必要的。對電極進(jìn)行再生是傳感器發(fā)展中重要的一部分[3,4]。由于抗原抗體之間的結(jié)合具有可逆性的特點，因此，傳感器的再生主要是將形成的免疫復(fù)合物解離開，但是抗原抗體結(jié)合后不易分開，要一些具有降低兩者間親和力的物質(zhì)對其進(jìn)行處理。常用的有檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、尿素[5]、甘氨酸-鹽酸緩沖液、乙二胺、鹽酸胍緩沖液[6]、強(qiáng)酸強(qiáng)堿及超聲清洗等[7]。此外，在再生過程中要盡可能的保持抗原抗體的活性，這也就要求對使用的再生溶液濃度或pH及再生時間等進(jìn)行優(yōu)化[8,9]。再生后電極的電流響應(yīng)會有所下降[10]，為了提高其可用性，本文對其進(jìn)行了氯金酸修飾。氯金酸修飾電極的方法參考納米金對電極的修飾方法，主要有恒電位沉積法[11,12]、自組裝法[13,14]、LB膜法[15,16]及種子媒介法。由于氯金酸修飾量較大時，會在電極的表面形成結(jié)晶塊，使修飾電極的比表面積減小、導(dǎo)電性降低[17]，故需對其修飾量和修飾時間進(jìn)行優(yōu)化。

在本研究中，我們采用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液作為再生液對電極上的免疫復(fù)合物進(jìn)行解離，優(yōu)化了再生液的解離條件；此外，對再生電極的氯金酸修飾條件進(jìn)行了優(yōu)化，并探討了氯金酸修飾對再生電極檢測性能的影響作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與耗材 使用過的多壁碳納米管纖維電極，根據(jù)實驗室之前的研究制備[18]，硫堇購自江萊生物；辣根過氧化物酶（HRP）抗體標(biāo)記試劑盒購自英國Innova Biosciences；EDC（1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳酰二亞胺鹽酸鹽）、NHS（N-羥基琥珀酰亞胺）購自美國PIERCE公司；氯金酸溶液（10 mmol/L）、H2O2購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白（BSA）購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液（PBS）為本實驗室自行配制；單增李斯特菌ATCC19115，購自中國科學(xué)院微生物研究所；單增李斯特菌多克隆抗體為本實驗室制備；實驗用水均為去離子水，試劑均為分析純。

1.1.2 實驗儀器 電化學(xué)工作站（chi660D上海辰華儀器有限公司）；鉑絲對電極（鹽城驕遠(yuǎn)分析儀器有限公司）；參比電極（232型上海精密科學(xué)儀器有限公司）；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司）；垂直混合器（HS-3，寧波新芝生物科技股份有限公司）；Synergy?2多功能酶標(biāo)儀購自美國博騰儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 檢測流程 采用循環(huán)伏安法進(jìn)行電化學(xué)測試。在實驗中，Relative Percentage(RP%)表示電極再生或氯金酸修飾前后電流變化的相對百分比RP%=(Ia-Ib)/Ia×100%，其中，Ia為電極再生液或氯金酸處理后的電流，Ib為電極再生或氯金酸處理前的電流。Current percentage(CP%)表示再生處理或氯金酸修飾后電極電流達(dá)到其原始電流的百分比，CP%=Id/Ic×100%，其中：Id為再生或氯金酸處理后電極的電流，Ic為電極的原始電流。

在氯金酸修飾前后再生電極的比較中，△Ipc=I1-I2。I1為免疫反應(yīng)前電極的電流，I2為免疫反應(yīng)后電極的電流。電化學(xué)測量是在一個含有三電極體系的電化學(xué)池中進(jìn)行，電化學(xué)池中含有0.1 M PBS，0.1 M NaCl和1 mM的硫堇。測試的工作電壓為-1.0 v～0.5 v相對于Ag/AgCl參比電極，掃描速率為0.1 v/s。單增李斯特菌的檢測是基于抗原抗體結(jié)合前后循環(huán)伏安曲線中還原峰峰電流的變化值△Ipc。

1.2.2 檸檬酸-檸檬酸鈉再生液的條件優(yōu)化 為使再生液有更好的再生效果，本研究對再生液的相關(guān)條件進(jìn)行了優(yōu)化，主要包括再生液濃度(0.05、0.1、0.15、0.20 mmol/L)、再生液pH(2.2、2.4、2.6、2.8、3.0)和再生時間(10、15、20、30、40 min)的優(yōu)化。優(yōu)化結(jié)果根據(jù)再生前后后電極電流的DP%及達(dá)到原始電流的C%進(jìn)行選擇。

1.2.3 氯金酸修飾條件的優(yōu)化 根據(jù)碳納米管纖維電極本身的大小特點，選取適量的氯金酸修飾量（25、50、75、100 μL）和修飾時間（30、60、90、120 min）進(jìn)行梯度優(yōu)化。根據(jù)修飾前后電極電流的RP%及修飾后電極的電流達(dá)到其原始電流的CP%來選擇氯金酸的修飾條件。

圖1 氯金酸修飾的酶免疫電極的制備Fig.1 The preparation of an enzyme immune electrode modified by chloroauric acid

1.2.4 基于氯金酸修飾的酶免疫電極的制備 制作過程如圖1所示。將經(jīng)再生液處理過的電極用0.01 mol/L、pH7.4的PBS緩沖液清洗3次，晾干后將一定量的氯金酸溶液覆蓋在碳納米管纖維表面靜置2 h，并清洗表面。然后根據(jù)化學(xué)鍵共價交聯(lián)法將經(jīng)過EDC、NHS活化后的氯金酸修飾電極置于HRP標(biāo)記的抗單增李斯特菌抗體中3 h，并用0.2%的BSA對未結(jié)合位點進(jìn)行30 min封閉，最后將清洗后的電極至于4°C冰箱中備用。再生免疫電極的制備方法與氯金酸修飾后制備免疫電極的方法相同。

1.2.5 氯金酸修飾對再生電極檢測性能的影響 電極在修飾了氯金酸之后在信號增強(qiáng)、偶聯(lián)抗體等方面都有所提升，為了驗證這一作用，本研究將再生免疫電極和氯金酸再生免疫電極分別置于5 mL的102～107cfu/mL單增李斯特菌稀釋液中，PBS做陰性對照，室溫孵育30 min后進(jìn)行循環(huán)伏安測試檢測，對單增李斯特菌的檢測靈敏度進(jìn)行了評價。此外，通過分別將不同時期制作的兩種免疫電極置于幾份平行（n=5）的5 mL的1×105cfu/mL的單增李斯特菌溶液中室溫孵育30 min后檢測電極的電流響應(yīng)，進(jìn)行了重現(xiàn)性分析。最后，在25 d內(nèi)對兩種免疫電極分別進(jìn)行第1、2、5、7、10、15、20、25 d的連續(xù)測試，觀察電流的變化，對電極的長期穩(wěn)定性進(jìn)行了評價。

2 結(jié)果與討論

2.1 檸檬酸-檸檬酸鈉再生液的優(yōu)化

2.1.1 檸檬酸-檸檬酸鈉濃度優(yōu)化 再生液檸檬酸-檸檬酸鈉的濃度對電極電流的影響如圖2所示。隨著再生液濃度的增大，電極再生前后電流變化的RP%也隨之增大，在0.1 mol/L時達(dá)到最大；當(dāng)再生液濃度繼續(xù)增大時，電流變化的RP%出現(xiàn)大幅度下降。此外，采用0.1 mol/L的濃度對電極進(jìn)行再生后，其電流值可達(dá)到初始電流的85.23%。因此，我們選擇了0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉作為再生液的最佳濃度。

圖2 再生液濃度對電極電流響應(yīng)的影響Fig.2 Influence of regenerated liquid concentration on electrode current response

2.1.2 檸檬酸-檸檬酸鈉pH優(yōu)化 pH對電極再生效果的影響如圖3所示。由圖可見，隨著pH的增加，電極再生前后電流變化的RP%也增大，當(dāng)pH達(dá)到2.4時，RP%達(dá)到最大；當(dāng)pH進(jìn)一步增加時，RP%急劇下降。pH主要影響抗原抗體之間的親和力，進(jìn)而影響Ag-Ab鍵的解離程度，當(dāng)pH增大時，使抗原抗體親和力下降的程度減小，致使免疫復(fù)合物的解離程度下降。且在pH2.4時，再生電極的電流達(dá)到其初始電流的CP%最大（86.63%），故此本文選取pH2.4為適宜的再生液pH。

圖3 再生液pH對電極電流響應(yīng)的影響Fig.3 Influence of regenerated liquid pH on electrode current response

2.1.3 檸檬酸-檸檬酸鈉再生時間優(yōu)化 圖4為再生時間對電極電流響應(yīng)的影響。在10～30 min內(nèi)，隨著時間的增加，再生前后電極電流變化的RP%整體上呈上升趨勢，至30 min時達(dá)到最大，當(dāng)時間繼續(xù)增加時，變化基本持平，但在30 min下再生電極的電流達(dá)到其初始電流的CP%（84.28%）比較40 min（75.08%）下大。因此選取對電極再生處理30 min。

圖4 再生時間對電極電流響應(yīng)的影響Fig.4 Influence of regeneration time on electrode current response

2.2 氯金酸修飾條件的優(yōu)化

氯金酸修飾量的優(yōu)化結(jié)果如圖5所示。在102.96～308.89 μg范圍內(nèi)，氯金酸修飾再生電極前后電流變化的RP%隨著修飾量的增大而增大，至308.89 μg時達(dá)到最大，當(dāng)繼續(xù)增加時，RP%基本不再變化。由于氯金酸加入較多時，會在電極的表面形成結(jié)晶塊，使修飾電極的比表面積減小[17]。且在308.89 μg的修飾量下，氯金酸修飾的再生電極的電流可達(dá)到其原始電流的144.6%，故選取308.89 μg的修飾量用于進(jìn)一步的實驗。

圖5 氯金酸修飾量對電極信號的影響Fig.5 Inluence of modification amount of chloroauric acid on electrode signal

氯金酸修飾時間對再生電極電流響應(yīng)的影響如圖6所示。在30～90 min內(nèi)，修飾前后再生電極電流變化的RP%成上升趨勢，在90 min時達(dá)到最大，再增加修飾時間，RP%的變化基本保持不變，這主要是因為在一定量的氯金酸下，隨著時間的增加氯金酸與電極之間的結(jié)合逐漸達(dá)到飽和。另外，在90 min時，相較于原始電流，氯金酸再生電極的電流增加到137.59%。故選取90 min為氯金酸的修飾時間。

圖6 氯金酸修飾時間對電極信號的影響Fig.6 Inluence of chloroauric acid modification time on electrode signal

2.3 氯金酸修飾對再生電極檢測性能的影響

兩種免疫電極對單增李斯特菌的檢測結(jié)果圖7所示。氯金酸再生免疫電極在102～107cfu/mL范圍內(nèi)檢測到目標(biāo)菌為（R2=0.958），LOD為2.1×102cfu/mL。再生免疫電極的檢測范圍為103～107cfu/ml（R2=0.940），LOD為3.08×103cfu/mL，并與原始電極對單增李斯特菌的檢測范圍102～105cfu/mL（R2=0.993），LOD為1.07×102cfu/mL進(jìn)行比較。由結(jié)果可知，電極經(jīng)再生之后，對目標(biāo)菌的檢測靈敏度下降，但是經(jīng)氯金酸修飾后，其檢測靈敏度顯著提高，并且接近原始電極的檢測水平。這是由于氯金酸修飾到電極上之后，對信號起到增強(qiáng)作用，且氯金酸對抗體等蛋白質(zhì)分子具有吸附能力，因此在同樣的實驗條件下氯金酸修飾的電極能夠結(jié)合較多的抗體，信號響應(yīng)較靈敏。此外，對單增李斯特菌的重現(xiàn)性分析及穩(wěn)定性測試結(jié)果也顯示氯金酸修飾后再生電極的性能得到了提高。

圖7 氯金酸對再生電極檢測靈敏度的影響Fig.7 The effect of chloroauric acid on detection sensitivity of regeneration electrode

25 d內(nèi)免疫電極的穩(wěn)定性測試結(jié)果如圖8所示。再生免疫電極的電流在第15 d時已經(jīng)下降至原始電流的74.68%；對于氯金酸-再生免疫電極，由于氯金酸的修飾加強(qiáng)了電極對抗體的結(jié)合、固定，在第15 d時，電流為其原始電流的84.55%，在20 d以后逐漸下降至原來的76.92%；并與15 d后電流下降至最初的91.69%的原始電極相比。由這些對比數(shù)據(jù)可以看出，氯金酸處理后對再生電極的電流性能恢復(fù)較為穩(wěn)定，可應(yīng)用于目標(biāo)物的檢測。

圖8 氯金酸對再生電極穩(wěn)定性的影響Fig.8 The effect of chloroauric acid on stability of regeneration electrode

在對單增李斯特菌的重現(xiàn)性實驗中，再生免疫電極的RSD為7.92%，氯金酸-再生免疫電流的RSD為6.62%，原始電極的RSD為6.18%。從結(jié)果可知，氯金酸修飾再生電極后提高了對抗體結(jié)合的牢固度，提高操作平行性，且與原始電極的水平相近。綜上所述，氯金酸修飾后的再生電極在檢測靈敏度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性方面都得到了顯著提升，展現(xiàn)出較好的應(yīng)用潛力。

3 結(jié)論

本文對電極的再生條件、氯金酸修飾條件及氯金酸對再生電極檢測性能的影響進(jìn)行了研究、分析。結(jié)果表明，在優(yōu)化的再生條件(0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉、pH2.4、30 min)下，電極的再生效果較好，再生后電極電流恢復(fù)至其原始電流的近85.38%；在308.89 μg氯金酸量、90 min修飾時間下再生電極的信號增強(qiáng)近60%。氯金酸對再生電極的修飾使其在原有的檢測范圍103～107cfu/ml，增加至102～107cfu/mL，LOD提高了14.6倍，穩(wěn)定性提升了近10%。氯金酸對再生電極的這些檢測性能有顯著提高，且氯金酸相較于納米金而言較大的降低了成本，為再生電極的使用提供了應(yīng)用潛力。

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