氘代同位素內(nèi)標液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定黃酒中的氨基甲酸乙酯

賈素中,歐 杰,王 婧,許 祿

上海海洋大學 食品學院;上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海 201306

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)是發(fā)酵食品和酒精飲料中的一種自發(fā)生成的伴隨產(chǎn)物。研究表明，氨基甲酸乙酯是一種多位點致癌物，可導致淋巴癌、肺癌、肝癌和皮膚癌等疾病[1-4]，并且與乙醇混合會促進其致癌性[3,4]。鑒于其具有致癌性，目前國際社會認為EC是食品中繼黃曲霉毒素之后的又一重大問題[2]。1974年，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）將其列為2B類致癌物。2007年3月，將EC從可能致癌物質(zhì)2B類提高為2A類[5]。在20世紀70、80年代，世界各國學者先后又在蒸餾酒（例如朗姆酒、威士忌、白酒等），發(fā)酵食品（腐乳、泡菜、醬油等），發(fā)酵酒精飲料（黃酒、啤酒、清酒）這些食品中檢測到了氨基甲酸乙酯[2]。1985年，加拿大的衛(wèi)生與防疫部門對酒精飲料中氨基甲酸乙酯含量制定了強制性限量標準。之后美國、英國、瑞士、韓國、日本等國家先后開展了有關(guān)氨基甲酸乙酯的毒理學、暴露水平和危險性評估的研究工作[6,7]。2002年聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)開始重點監(jiān)控發(fā)酵食品中的氨基甲酸乙酯，并制定了國際標準，規(guī)定其含量不能超過20 μg/L[7,8]。中國雖然目前暫時還沒有對氨基甲酸乙酯做任何明確的限定標準，但是人們對氨基甲酸乙酯的關(guān)注卻日益增多[9]。為了更好的監(jiān)控我國黃酒中EC含量，適時開發(fā)出一種操作比較簡單、速度較快、高效的檢測方法就顯得非常重要了。

目前國內(nèi)外關(guān)于EC的檢測方法眾多，主要有二氯甲烷/氣相色譜-質(zhì)譜法（GC/MS）、固相微萃取/氣相色譜-質(zhì)譜法（GC/MS）[10-12]，氣相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[13-15]，二維或多維色譜穩(wěn)定同位素稀釋質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，氣相色譜/熱離子檢測器（GC/TSD）法，高效液相色譜結(jié)合熒光檢測器(HPLC-FLD)法[16-18]，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)、薄層色譜法[19]，也有免疫相關(guān)方法的研究[20]，但是未見在免疫相關(guān)方面的成熟應用。

本文建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定黃酒中氨基甲酸乙酯的分析方法。該方法利用了液相色譜高效的分離能力和四級桿質(zhì)譜的高靈敏度的定量檢測能力，樣品前處理比較簡單，采取直接進樣的方式，簡單、快速、準確。并對方法的檢出限、線性、樣品加標回收率及精密度等方法評價標準進行了研究，得到了較為滿意的結(jié)果。

1 實驗材料和方法

1.1 儀器與試劑

儀器：采用2695 Quattro Micro型液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Waters公司)；AR1140電子天平（精確到0.0001 g）(梅特勒-托利多儀器有限公司)；SK3-SB2200超聲波清洗器(必能信超聲（上海）有限公司)；0.22μm有機濾膜(上海安普科學儀器有限公司)；Milli-Q Reference超純水發(fā)生器(美國Waters公司)。

試劑：氨基甲酸乙酯(EC CAS:51-79-6純度99.9%(德國Dr.Ehrenstorfer公司)-18℃保存)；D5-氨基甲酸乙酯(D5-EC內(nèi)標CAS:73962-07-9純度99.8%(美國Sigma-Aldrich公司)-18℃保存)；甲醇、乙腈、甲酸、乙酸、乙酸銨(HPLC級)；超純水:由Milli-Q超純水機提供。

不同種類的黃酒樣品均在上海某超市購買。

1.2 標準儲備液的制備

用電子天平分別準確稱取EC和D5-EC各10.0 mg(精確到0.1 mg)于10 mL的棕色瓶內(nèi)，用甲醇水溶液（v:v=25:75）定容至刻度線，分別配制成1000 mg/L的標準儲備液，（-20℃保存，有效期為1個月）。再根據(jù)需要逐級稀釋到實驗所需要的濃度。

1.3 檢測條件

1.3.1 LC的檢測條件 Waters SunFireTMC18色譜柱（2.1×50 mm column，3.5 μm）為分析柱，流動相為甲醇(A)和0.1%的乙酸水溶液(B)，洗脫程序：25%A和75%B等梯度洗脫，流速為0.30 mL/min，柱溫為40℃，自動進樣量為10 μL。

1.3.2 MS的檢測條件 電噴霧離子源正離子模式（ESI+），檢測方式為多反應監(jiān)測模式（MRM模式），毛細管電壓為3.00 kV；離子源溫度120℃；脫溶劑氣流速為600 L/h，脫溶劑溫度350℃，錐孔氣流速50 L/h，碰撞氣體為惰性氣體氬氣(Ar)，掃描方式為正離子掃描，駐留時間50 ms。

1.4 樣品的前處理

準確量取1.00 mL黃酒置于10 mL容量瓶內(nèi)，用甲醇-水溶液（v:v=25:75）定容至刻度線，然后加入一定量的內(nèi)標D5-EC，振蕩器混勻。然后通過0.22 μm的有機濾膜，上機備用。

1.5 定性定量

采用自動進樣，進樣量為10 μL，分別選擇m/z61.9和m/z62.9作為EC和D5-EC的定量離子，測定EC(m/z90.0/61.9)和D5-EC(m/z95.1/62.9)的峰面積，以二者的峰面積比值比與標準系列溶液中EC的濃度(μg/L)繪制標準曲線，根據(jù)測定的樣品溶液中EC和D5-EC的峰面積比從標準曲線上得到樣品溶液中EC的濃度，從而可計算出樣品中EC含量(μg/L)[19]。以保留時間和EC標準溶液測定的m/z 61.9作為定性依據(jù)。在實際樣品測定EC時保留時間范圍小于±0.5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

樣品中的EC若采取傳統(tǒng)的固相微萃取或者用有機溶劑液液萃取，不僅回收率低而且重現(xiàn)性較差。該方法采用直接進樣的方式進行分析，為了減少基質(zhì)效應對被測組分EC的干擾，本實驗采用對樣品進行適當?shù)南♂尅Ｍㄟ^考察對樣品進行1～15倍的稀釋，發(fā)現(xiàn)隨著稀釋倍數(shù)的逐漸增大，基線較穩(wěn)，峰形較好，基質(zhì)效應對樣品測定的影響逐漸變?。?～4倍響應值最好），當繼續(xù)稀釋時，被測組分濃度較低，基線不穩(wěn)，峰形開始變差，響應值較低。因此本文采用對黃酒樣品進行2～4倍稀釋。

2.2 實驗條件的優(yōu)化

2.2.1 LC條件 為了得到較好的色譜圖和改善分離效果，對反相柱常用的有機流動相（如乙腈、甲醇），常用的水相（如甲酸、乙酸、甲酸銨、乙酸銨溶液）進行了分離和質(zhì)譜考察，分析色譜峰和離子化程度。結(jié)果表明甲醇-水的洗脫效果比較好，在甲醇-水流動相體系中加入乙酸后發(fā)現(xiàn)不但可以獲得較高的分離度和靈敏度，進一步分析0.1%和0.2%乙酸，發(fā)現(xiàn)加入0.1%的乙酸響應值較高，所以本實驗的流動相體系選擇甲醇-水溶液（0.1%乙酸）。標準品EC和D5-EC的MRM模式下的色譜圖如下圖1。

圖1 EC（20 μg/L）和D5-EC（20 μg/L）標準溶液的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of EC(20 μg/L)and D5-EC（20 μg/L）

2.2.2 MS條件 采用MRM模式采集EC和D5-EC的母離子及對應的響應比較好的子離子，EC和D5-EC的相對分子質(zhì)量都比較小，電離后只能選出一個特征離子作為定性和定量離子，EC和D5-EC的保留時間、母離子、子離子、以及錐孔電壓和碰撞能量等參數(shù)見表1。

表1 EC和D5-EC的質(zhì)譜條件Table 1 MS-MS parameters for EC and D5-EC

將被測組分進行全掃描檢測，得到一級質(zhì)譜圖，EC為m/z90.0，D5-EC為m/z95.1（如圖2和3），然后用惰性氣體Ar轟擊母離子，獲得其二級質(zhì)譜圖及其碎片離子。EC和D5-EC的二級特征離子分別為m/z61.9和m/z44，與m/z 62.9和m/z44，m/z44的碎片離子是由母離子脫去乙氧基形成的，其離子豐度較小，而m/z61.9和m/z62.9是由母離子脫羰基形成的，離子豐度很大。我們一般定量一個化合物時通常用2個子離子都能被觀察到，本實驗所測的EC濃度很低時，m/z90.0/44信號很弱，但是m/z90.0/61.9的信號非常的強，特征非常明顯，因此可以對EC進行檢測和定量分析。D5-EC在理化特性和色譜分離行為中具有與EC非常相似的表現(xiàn)，能夠更好地校正分析過程中各種因素對EC測定結(jié)果的影響，提高EC分析的回收率，使檢測結(jié)果更準確、穩(wěn)定。目標化合物相對分子比較小，結(jié)構(gòu)簡單，經(jīng)過質(zhì)譜碰撞分裂后只能得到一個比較明顯的特征碎片離子。我們根據(jù)母離子(m/z90.0和m/z95.1)及非常明顯的特征碎片離子(m/z61.9和m/z62.9)組成定性和定量離子對，同時根據(jù)保留時間以及離子豐度對目標化合物EC進行定性定量分析。

圖2 EC的一級質(zhì)譜掃描圖Fig.2 Full scan mass spectrum of EC

圖3 D5-EC的一級質(zhì)譜掃描圖Fig.3 Full scan mass spectrum of D5-EC

2.3 線性范圍與檢出限以及定量限

分別配制一系列不同濃度的EC標準溶液濃度為2，5，10，20，40，80，200，500 μg/L，D5-EC標準液20 μg/L按上述色譜-質(zhì)譜操作條件進行測定，記錄標準溶液EC和D5-EC的響應值，然后以EC和D5-EC的濃度比為橫坐標，以EC和D5-EC的峰面積比為縱坐標進行線性回歸方程，獲得EC的標準曲線及相關(guān)系數(shù)，標準曲線線性關(guān)系和檢測限為:回歸方程Y=1.06х+0.147，R2=0.9922（х為EC和D5-EC的濃度比，Y為EC和D5-EC響應比）以樣品分析中靠近EC色譜峰的基線噪音值，按信噪比S/N為3確定其檢測限（LOD）為1.8 μg/L，以S/N為10確定定量限(LOQ)為5.0 μg/L。

2.4 回收率和精密度

從市場上購買的三種酒樣各取250 mL經(jīng)過0.22 μm的有機濾膜過濾,經(jīng)過適當稀釋倍數(shù)后取1 mL備用，再分別添加10 μg/L、20 μg/L和100 μg/L氨基甲酸乙酯標準溶液，充分混合上機測定，每個添加水平測定6次，分別測定不同品牌的黃酒高低濃度的加標回收率為88.9%～103.1%；考察方法精密度，EC含量的相對標準偏差均小于10%，符合方法性能指標的要求，測定結(jié)果見表2。

表2 黃酒中氨基甲酸乙酯回收率和相對標準偏差（RSD）(n=6)Table 2 Recoveries and relative standard deviations(RSDs)of EC spiked in Chinese rice wine(n=6)

2.5 實際樣品的測定

根據(jù)以上建立的方法，分別對市場上購買的10種黃酒樣品，每種樣品平行測定3次，測定結(jié)果見表3。通過檢測發(fā)現(xiàn)市場上購買的黃酒均檢出了一定含量的EC，當年釀造黃酒中EC含量較低，陳釀黃酒中EC含量普遍偏高，并且陳釀時間越長，其中的EC濃度越高。

表3 實際樣品中EC含量 (n=3)Table 3 Contents of EC in real samples(n=3)μg/L

3 結(jié)論

建立了以D5-氨基甲酸乙酯作內(nèi)標物，利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法直接快速測定黃酒中氨基甲酸乙酯（EC）含量的方法。該方法能以高效的分析效率快速完成整個分析過程（10 min內(nèi)），與以往的方法比較大大縮短了分析檢測時間。且樣品經(jīng)過簡單稀釋后直接進樣，不需要濃縮、萃取以及凈化等復雜的前處理過程。該方法準確、可靠、靈敏度高，方法重現(xiàn)性較好，能夠滿足酒類產(chǎn)品中氨基甲酸乙酯的常規(guī)快速檢測。

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